分子生物學在食品檢驗中的應(yīng)用

秦鵬鈞

摘 要：隨著人們生活水平的提高，人們對食品安全問題越來越重視。研究和建立食源性致病菌快速檢測方法越來越受到社會的廣泛關(guān)注。本文主要從分子生物學角度綜述起在食品檢驗中的應(yīng)用，包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及相關(guān)技術(shù)、寡核苷酸探針技術(shù)、DNA指紋圖譜技術(shù)等。

關(guān)鍵詞：食品安全;分子生物學;食品檢測

近年來，世界各地區(qū)食品安全惡性事件頻繁發(fā)生。據(jù)報道，2020年7月29日，約旦首都安曼發(fā)生大規(guī)模食物中毒事件，導(dǎo)致至少700人中毒，其中一名兒童死亡。此外，因食品安全問題，美國先后召回2 800萬箱谷物早餐制品、5.5億枚雞蛋。食品安全問題給各個國家和人民帶來了巨大的損失和痛苦。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測微生物時，受到食品環(huán)境脅迫或受損的微生物細胞通常需要在特殊的培養(yǎng)條件才能恢復(fù)生長，導(dǎo)致其難以被分離。發(fā)展及時、準確檢出食品中微生物的技術(shù)迫在眉睫，這一現(xiàn)象促進了以PCR等為代表的分子生物學技術(shù)在食品微生物及相關(guān)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用和發(fā)展。分子生物學技術(shù)具有快捷、靈敏、準確等優(yōu)點，可精確確定存在于食品中的微生物種類及菌群情況。

1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及相關(guān)技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)是由K. Mullis建立的一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。它利用變性與復(fù)性原理，使用DNA聚合酶，在引物和dNTP的參與下，在數(shù)小時內(nèi)在體外對特異DNA片段進行百萬倍擴增[1]。這種技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點。

1.1 多重PCR技術(shù)

食品中通常含有不止一種致病菌，而普通PCR技術(shù)僅可對單一致病菌進行定量定性分析，在此技術(shù)基礎(chǔ)上衍生了多重PCR技術(shù)，通過對引物、溫度等條件的改變，可對兩種或兩種以上致病菌進行同時檢測，是食源性致病菌檢測的重要發(fā)展發(fā)向。Elizaquivel等運用該技術(shù)對沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行同時檢測[2]。

1.2 RT-PCT

RT-PCT（反轉(zhuǎn)錄PCR），以mRNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后將此為模板，使用特異性引物，擴增目的序列[3]。該法可在基因表達水平層面上檢測細胞或者組織，還可以檢測細胞中RNA病毒的含量或直接擴增特定基因的cDNA等。

1.3 實時定量熒光PCR技術(shù)

該技術(shù)是將熒光分子加入反應(yīng)體系中，然后通過檢測熒光信號來實時反映DNA量，可以實時觀測到PCR產(chǎn)物。而多重實時熒光定量PCR可實現(xiàn)大腸桿菌、沙門菌和金葡球菌的同時、高效共檢。相關(guān)人員利用該方法，對40份食品樣品中的單增李斯特氏菌進行了檢測，其靈敏度達只需19個細菌就可以得到陽性結(jié)果[4]。

2 以16S rRNA為靶基因進行的檢測技術(shù)

16S rRNA存在于所有原核細胞中，有較高的拷貝數(shù)，其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū)，因此可設(shè)計群、屬、種特異性探針進行微生物檢測。對細菌中的16S rRNA基因進行測序是當前細菌鑒定的“金標準”。馮金牛等人利用該方法對鴨疫里默氏桿菌DNA進行檢測的最小檢出量為1.907×10-5 g/L，菌液的最小檢出量為1.5×104 CFU/mL[5]。

3 DNA指紋圖譜技術(shù)

英國遺傳學家Jefferys等在1984年將人源小衛(wèi)星DNA用作基因探針，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了長度不等的雜交帶圖紋，因為獲得的圖紋幾乎都不相同，其個體識別能力足以與手指指紋相媲美。目前，隨著科技的發(fā)展，已衍化出多種技術(shù)。

3.1 變性梯度凝膠電泳標記技術(shù)（DGGE技術(shù)）

DGGE技術(shù)是在變性劑的作用下從而使DNA片段電泳遷移率發(fā)生變化，使片段大小相同堿基不同的DNA片段分開。在食品中微生物的分離、鑒定中使用廣泛，也可以確定生物群落的變化。Ampe等利用該技術(shù)檢測酸化木薯淀粉發(fā)酵過程中的生物群落，檢測到鏈球菌、乳球菌等微生物[6]。

3.2 溫度梯度凝膠電泳技術(shù)（TGGE技術(shù)）

TGGE技術(shù)是在DGGE基礎(chǔ)上進一步發(fā)展的技術(shù)，與DGGE不同的是，該技術(shù)在引物的5端加入3 050 bp的GC片段且有溫度梯度變化[7]。該技術(shù)的特點是可以發(fā)現(xiàn)目前尚未被認識的腸道細菌，但在食品檢驗中的應(yīng)用較少。

3.3 隨即擴增多態(tài)DNA技術(shù)（RAPD技術(shù)）

RAPD技術(shù)的特點是引物隨機，擴增后會得到不同大小的DNA，通過分子標記，對不同大小的DNA進行差異性分析。該技術(shù)以整個細菌DNA基因組為對象，特異性和敏感性較高，在分子生物學研究甚少的領(lǐng)域或者分子生物學特征不明確或不了解基因組DNA序列的真菌和乳酸菌的檢測中都可以應(yīng)用該技術(shù)。實際應(yīng)用中在品種純度檢測方面應(yīng)用較多。如余四斌等人利用該技術(shù)快速鑒定雜交水稻種子的純度[8]。

3.4 核糖體RNA基因分析技術(shù)

現(xiàn)存的所有生物基本都含有核糖體，且rRNA序列在同種生物細胞中的差異很小，在不同的生物種群中可以通過對比堿基進行分析，相應(yīng)的技術(shù)方法即是核糖體RNA基因分析技術(shù)，在菌株的分離鑒定中有極大的優(yōu)勢。該技術(shù)可用于副溶血性弧菌、李斯特菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等的檢測[9]。

4 分子印跡技術(shù)

1975年Southern首先提出了分子印跡的概念。原理是將一個具有特定形狀和大小的、可識別的分子作為模板分子，將其溶于交聯(lián)劑中，再加入特定的功能單體聚合物后，形成高度交聯(lián)的聚合物，其內(nèi)部包埋有可與功能單體相互作用的模板分子，然后利用物理或化學方法將模板分子洗脫，這樣聚合物母板上留下了與模板分子形狀相似的孔穴，且孔穴內(nèi)各功能基團的位置與所用的模板分子互補，可與模板分子發(fā)生特殊的結(jié)合作用，從而實現(xiàn)對模板分子的識別[10]。近年來，分子印跡技術(shù)運用十分廣泛，無論是DNA、RNA還是蛋白質(zhì)層面的檢測都可運用該技術(shù)。

4.1 Western blotting

Western blotting即為蛋白質(zhì)印跡法。它的原理是抗原抗體的特異性結(jié)合。將從待測樣品中提取的分子大小不同的蛋白質(zhì)（抗原）混合物用凝膠電泳法分離后，將其轉(zhuǎn)移到固定支持物上，用帶有標記的抗體做探針與之雜交，通過放射自顯影等技術(shù)檢測基因表達的產(chǎn)物。金明國等人就是利用通過Western blotting技術(shù)準確檢測馬檳榔甜蛋白[11]。

4.2 Dot blotting

Dot blotting即為斑點印跡技術(shù)。它是一種酶免疫分析技術(shù)。它的原理是用點滴法或電斑法將抗原轉(zhuǎn)移到尼龍膜上或硝基纖維膜上。該法敏感度極高，毫/微克水平的特異性抗原也可以成功檢出。斑點印跡技術(shù)對實驗室及設(shè)備的要求低，是比較容易掌握的一門技術(shù)。楊靖亞等人利用斑點印跡法技術(shù)特異性檢測致病性副溶血弧菌，靈敏度高、操作簡單，可用肉眼判定結(jié)果[12]。

參考文獻

[1]盧生棟.現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，1999.

[2] Elizaquivel P，Aznar R.A multiplex RTi-PCR reaction for simultaneous detection of Escherichia coli O157：H7，Salmonella spp.and Staphylococcus aureus on fresh， minimally processed vegetables[J].Food Microbiology，2008，25：705-713.

[3] Cheng A，Wang M，Xin H，et al.Deveiopment and application of a reverse transcriptase chain reaction to detdct Chinese isolates of duck hepatitis virus type 1[J].Journal of Microbiological Method，2009，77：333-336.

[4]吳曉芳，韓建康，紀蕾，等.多重實時熒光PCR快速檢測沙門菌和單增李斯特菌[J].疾病監(jiān)測，2011（3）：234-237.

[5]馮金牛，陳芳艷，阮二壘，等.鴨疫里默氏桿菌16 S rRNA PCR快速檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學，2010（4）：395-399.

[6] Ampe F，Ben Omar N，Moizan C，et al.Polyphasic study of the spatial distribution of microorganisms in Mexican pozol，afermented maize dough，demonstrates the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations[J].Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5464-5473.

[7]周琳，張曉君，李國勛，等.DGGE/TGGE技術(shù)在土壤微生物分子生態(tài)學研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2006（5）：67-71.

[8]余四斌，徐才國.用RAPD技術(shù)鑒定水稻種子純度初探[J].種子，1996（5）：56-57.

[9]肖劍.分子生物學技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用[J].廣西輕工業(yè).2011（3）：10-12.

[10]周振中，李彩霞.分子印跡技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012（7）：3967-3972.

[11]金明國， 李雄彪. 用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測馬檳榔甜蛋白[J]. 南開大學學報（自然科學版）， 1995（1）：63-67.

[12]楊靖亞，張建，趙勇，等.Western斑點印跡法檢測致病性副溶血弧菌[J].食品科學，2010（20）：413-416.