血漿Septin9甲基化在肝癌鑒別診斷中的臨床價(jià)值*

沈志明,馮 杰，魏 靜，顏光濤△

(1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西贛州 341000；2.解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，北京 100853)

原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)在我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤中居第4位，在腫瘤致死病因中居第3位，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命和健康[1-2]。我國(guó)每年死于肝癌的患者約35萬(wàn)人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的50%以上[3]。肝癌的病理類型主要包括肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌和兼有兩者的混合細(xì)胞型肝癌，各型的發(fā)病機(jī)制、組織學(xué)形態(tài)、生物學(xué)行為、治療方法及預(yù)后等方面均有明顯的不同[4]。其中肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌占比較高，目前肝細(xì)胞癌及膽管細(xì)胞癌的影像學(xué)表現(xiàn)類似，且兩者都表現(xiàn)為肝內(nèi)占位，因?yàn)閮烧咧委熀皖A(yù)后不同，臨床上輔助其他血液檢驗(yàn)手段充分進(jìn)行鑒別對(duì)其治療方案的選擇至關(guān)重要。近年的研究表明,SEPT家族某些成員尤其Septin9與腫瘤的發(fā)生直接相關(guān),其功能研究正逐漸成為惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制研究的新熱點(diǎn)[5]。但在肝癌中報(bào)道的比較少。本文通過(guò)探究血漿Septin9甲基化和其他指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在肝癌篩查中的臨床意義，為肝癌的篩查和鑒別診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2018年11月至2019年11月在解放軍總醫(yī)院確診且臨床病理資料完整的肝細(xì)胞癌患者175例和膽管細(xì)胞癌患者101例分別納入肝細(xì)胞癌組、膽管細(xì)胞癌組，并選取該院同期體檢健康人員163例為健康對(duì)照組。175例肝細(xì)胞癌組患者中男144例，女31例；101例膽管細(xì)胞癌組患者中男58例，女43例；163例健康對(duì)照組中男108例，女55例。3組之間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn) ：(1)首次發(fā)現(xiàn)并在解放軍總醫(yī)院住院治療，沒(méi)有接受任何放化療 ；(2)住院期間通過(guò)肝穿刺檢查并取活體組織行病理診斷，依據(jù)《美國(guó)癌癥分期聯(lián)合會(huì)(AJCC)癌癥分期手冊(cè)(第7版)》明確肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌診斷；(3)住院后測(cè)定血清總膽紅素 (TBIL)、直接膽紅素 (DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、堿性磷酸酶 (ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、血清總蛋白(TP)、血清清蛋白(ALB)水平及腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、糖類抗原153(CA153)、糖類抗原199(CA199)、糖類抗原125(CA125)和血漿Septin9甲基化。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有免疫系統(tǒng)疾病史者；(2)急性或慢性炎癥感染者；(3)合并其他原發(fā)性腫瘤患者；(4)其他腫瘤轉(zhuǎn)移性肝癌患者。本研究通過(guò)了解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2方法 所有患者都于住院后治療前采靜脈血送檢，通過(guò)臨床電子病歷系統(tǒng)收集患者性別、年齡等一般資料和檢驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)，肝功能項(xiàng)目在羅氏C701分析儀上檢測(cè)，其中ALP、GGT、ALT、AST、TP、ALB 使用原裝試劑，TBIL、DBIL 使用和光純耀試劑。腫瘤標(biāo)志物項(xiàng)目在羅氏e601分析儀上采用原裝試劑檢測(cè)。血漿Septin9甲基化采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。測(cè)試標(biāo)本內(nèi)參基因β-actin的Ct值≤32.1時(shí)為判定有效，試劑盒提供了陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1各組間血漿Septin9甲基化陽(yáng)性表達(dá)率比較 肝細(xì)胞癌組Septin9甲基化陽(yáng)性表達(dá)108例，陰性表達(dá)67例，陽(yáng)性表達(dá)率為61.7%；膽管細(xì)胞癌組Septin9甲基化陽(yáng)性表達(dá)40例，陰性表達(dá)61例，陽(yáng)性表達(dá)率為39.6%；健康對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率為0.0%，兩兩組間陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組間血漿Septin9甲基化陽(yáng)性表達(dá)率

2.23組間肝功能和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)指標(biāo)比較 除年齡外，3組間男女發(fā)病比例、肝功能、腫瘤標(biāo)志物比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。膽管細(xì)胞癌組ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT、CA199、CA125、CA153水平高于肝細(xì)胞癌組和健康對(duì)照組(P<0.01)，其ALB水平低于肝細(xì)胞癌組和健康對(duì)照組(P<0.01)，TP、AFP水平則低于肝細(xì)胞癌組(P<0.05)。肝細(xì)胞癌組ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT、AFP、CA199、CA125水平高于健康對(duì)照組(P<0.01)，其ALB水平則低于健康對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 3組一般資料、肝功能、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)指標(biāo)比較

2.3肝癌危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 通過(guò)SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)納入的肝功能指標(biāo)、血漿Septin9甲基化水平及腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行二分類Logistic回歸分析，采用Backward：LR方式進(jìn)行指標(biāo)篩選，發(fā)現(xiàn)GGT和血漿Septin9甲基化檢測(cè)在回歸模型中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，通過(guò)GGT和血漿Septin9甲基化檢測(cè)建立二分類Logistic回歸模型，此模型對(duì)肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌的鑒別診斷準(zhǔn)確率為78.3%。見(jiàn)表3。

表3 基于GGT和血漿Septin9甲基化檢測(cè)建立二分類Logistic回歸模型

2.4GGT和血漿Septin9甲基化檢測(cè)對(duì)肝癌的鑒別診斷價(jià)值 GGT和Septin9甲基化聯(lián)合鑒別診斷肝細(xì)胞癌的AUC為0.845(95%CI：0.797～0.893)，明顯優(yōu)于GGT的0.779(95%CI：0.718～0.841)和Septin9甲基化的0.611(95%CI：0.541～0.680)(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)取約登指數(shù)最大時(shí)靈敏度為88.6%，特異度為68.3%，優(yōu)于GGT、Septin9單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的靈敏度(84.0%、61.7%)、特異度(67.3%、60.4%)。

圖1 基于GGT、Septin9及其組合的ROC曲線

3 討 論

Septin9基因位于17q25.3，主要編碼Septin9甲基化，其主要生物學(xué)功能參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)形成及細(xì)胞質(zhì)分裂。Septin9基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，并容易轉(zhuǎn)化為腫瘤[6]。有基因芯片檢測(cè)分析表明,除了在結(jié)直腸癌中高表達(dá),Septin9還在卵巢、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、乳腺、甲狀腺、膀胱和前列腺等來(lái)源的實(shí)體腫瘤中高表達(dá)[7-8]。目前致癌的發(fā)病理論“腺瘤→癌變”學(xué)說(shuō)主要是指染色體不穩(wěn)定、微環(huán)境不穩(wěn)定及胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤(CpG)島上甲基化這3種致病機(jī)制[9-10]。至于導(dǎo)致癌變的原因有可能是其中一種或多種機(jī)制組合而成，但可以明確位于CpG島上的基因啟動(dòng)子約占人類基因啟動(dòng)子的一半，使其成為癌變的主要原因。它們誘導(dǎo)癌癥共同的途徑都是異?；蚣谆瘜?dǎo)致相應(yīng)基因的異常表達(dá)，主要特定癌癥相關(guān)基因(尤其是腫瘤抑制基因)，最后導(dǎo)致正常生理功能紊亂。部分文獻(xiàn)研究已明確表明Septin9基因在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[11-13]。夏常青等[14]研究表明Septin9甲基化陽(yáng)性率為73.4%，證實(shí)血漿Septin9甲基化在結(jié)直腸癌診斷中具有重要價(jià)值。本研究中肝細(xì)胞癌組Septin9甲基化陽(yáng)性表達(dá)率[61.7%(108/175)]高于膽管細(xì)胞癌組[39.6%(40/61)]和健康對(duì)照組(0.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，Septin9甲基化在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中也充當(dāng)了非常重要的角色，甚至可以推測(cè)在肝癌發(fā)展過(guò)程中，Septin9基因同樣起到了抑癌基因的作用。Septin9甲基化抑制了該基因的正常表達(dá)，導(dǎo)致其腫瘤抑制功能喪失，最終致異常肝細(xì)胞過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。鑒于Septin9甲基化在肝癌中的高陽(yáng)性率，可以通過(guò)檢測(cè)血漿Septin9甲基化水平，用于肝細(xì)胞癌早篩和診斷，同時(shí)也有助于其與膽管細(xì)胞癌的鑒別診斷。相比常規(guī)檢測(cè)腫瘤的方法，如X線檢查、病理活檢、細(xì)胞穿刺等，前者存在輻射，后兩個(gè)為有創(chuàng)檢查。檢測(cè)Septin9甲基化進(jìn)行肝癌篩查和早期診斷可以做到早期發(fā)現(xiàn)、早期治療，且無(wú)創(chuàng)，容易普及，可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，有望成為肝細(xì)胞癌的新腫瘤標(biāo)志物。

GGT屬于一種質(zhì)膜結(jié)合糖蛋白，廣泛分布于腎臟、肝臟、胰腺、腸等人體內(nèi)多種組織中，其和TBIL、DBIL和ALP升高可見(jiàn)于梗阻性黃疸、膽汁淤積性肝炎和肝癌等疾病中。健康人血清GGT來(lái)源于肝臟，主要存在于肝細(xì)胞膜和微粒體上，廣泛分布于肝細(xì)胞的毛細(xì)膽管一側(cè)和整個(gè)膽管系統(tǒng)，參與谷胱甘肽的代謝[15]。當(dāng)肝內(nèi)合成亢進(jìn)或膽汁排泄障礙時(shí)，特別是酒精性肝病或肝臟膽管腫瘤，血清中GGT升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌組和膽管細(xì)胞癌組中ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT高于健康對(duì)照組，同時(shí)膽管細(xì)胞癌組較肝細(xì)胞癌組更高(P<0.01)。由于膽管細(xì)胞癌為來(lái)源于膽道上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，可發(fā)生于膽道系統(tǒng)的各級(jí)膽管，其較肝細(xì)胞癌更容易出現(xiàn)膽道梗阻和膽汁排泄障礙，因此，ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT在膽管細(xì)胞癌組升高更為明顯。其中GGT升高最為明顯，升高的程度和膽道梗阻程度相關(guān)，成為鑒別診斷膽管細(xì)胞癌的重要指標(biāo)。同時(shí)腫瘤標(biāo)志物CA199是一種低聚糖類腫瘤相關(guān)的糖類抗原，血清CA199明顯增高可出現(xiàn)在消化系統(tǒng)腫瘤患者中，其水平可為正常均值的535倍[17]，本研究顯示肝細(xì)胞癌組CA199、CA125、CA153低于膽管細(xì)胞癌組(P<0.01)，而膽管細(xì)胞癌組CA199升高最明顯，CA125、CA153次之。

研究表明，AFP是目前臨床應(yīng)用最廣的早期檢測(cè)肝細(xì)胞癌的指標(biāo)[18]。然而單一AFP檢測(cè)存在假陽(yáng)性率較高及部分患者AFP正?；蚱偷燃訇幮匀秉c(diǎn)[19]。因此，積極尋找診斷肝癌的重要指標(biāo)和特異度強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。本研究肝細(xì)胞癌組TP、ALB 、AFP高于膽管細(xì)胞癌組(P<0.01)，證實(shí)AFP在診斷肝細(xì)胞癌中確實(shí)發(fā)揮重要作用，而蛋白相對(duì)高說(shuō)明肝細(xì)胞癌營(yíng)養(yǎng)狀況相比膽管細(xì)胞癌更好。本研究中GGT和血漿Septin9甲基化檢測(cè)在回歸模型中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，發(fā)現(xiàn)GGT和血漿Septin9甲基化聯(lián)合檢測(cè)具有更高的價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.845(95%CI：0.797～0.893)，約登指數(shù)最大時(shí)的靈敏度為88.6%，特異度為68.3%。該模型對(duì)肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌的鑒別診斷準(zhǔn)確率為78.3%，均優(yōu)于單一指標(biāo)檢測(cè)的診斷價(jià)值。因此，GGT和血漿Septin9甲基化兩者聯(lián)合檢測(cè)可為肝癌的早期鑒別及診斷提供一定的參考依據(jù)，可以作為肝癌早期篩查和診斷新的腫瘤標(biāo)志物。關(guān)于血漿Septin9甲基化陽(yáng)性率與肝癌的研究鮮有報(bào)道，本研究納入的研究對(duì)象較少，設(shè)計(jì)存在一定局限性，病理金標(biāo)準(zhǔn)的一致性和各指標(biāo)組合性能驗(yàn)證需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

血漿Septin9甲基化在肝癌的高陽(yáng)性率報(bào)道甚少，有望能成為肝癌診療和預(yù)測(cè)的新腫瘤標(biāo)志物，需引起臨床的重視和關(guān)注。肝癌的鑒別診斷對(duì)其治療極其重要，血漿Septin9甲基化和GGT聯(lián)合檢測(cè)可為其臨床鑒別診斷提供方向。