曹 敏，張曉敏，王培昌，劉 靜

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053)

固有淋巴樣細(xì)胞(ILCs)是最近發(fā)現(xiàn)的一種天然免疫細(xì)胞，ILCs是由造血干細(xì)胞(HSC)分化而來(lái)，HSC向ILCs分化的途徑為：長(zhǎng)期造血干細(xì)胞(LT-HSCs)→ 短期造血干細(xì)胞(ST-HSCs)→多能祖細(xì)胞(MPPs)→共同淋系祖細(xì)胞(CLP )→髓樣淋巴祖細(xì)胞(CMP)→ILC前體細(xì)胞(ILCP)→各類ILCs[1]。ILCs主要分為3個(gè)亞群：ILC1亞群(ILC1s)、ILC2亞群(ILC2s)和ILC3亞群(ILC3s)[2]。目前研究認(rèn)為，ILC1s存在于腸道和肝臟中，在病毒感染早期及肝臟損傷中發(fā)揮免疫作用[3-4]；ILC2s主要存在與腸道、肺部和血液中，與哮喘、過(guò)敏性皮炎有關(guān)[5-6]；ILC3s主要存在于淋巴結(jié)和腸道中，在炎癥性腸病及清除胞內(nèi)寄生菌感染中發(fā)揮免疫作用[7-8]。目前檢測(cè)小腸組織中ILC3頻率的方法主要依靠流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合胞內(nèi)染色，但是在染色過(guò)程中諸多因素會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。由于小腸中ILC3含量較少且含有胞內(nèi)抗原，需對(duì)其固定破膜后染色，固定破膜效果如何將成為影響小腸中ILC3檢測(cè)水平的一項(xiàng)重要因素[9]。本研究中，課題組比較不同廠家的破膜試劑(BD公司破膜劑、eBioscience公司破膜劑、聯(lián)科生物公司破膜劑)對(duì)小腸中ILC3檢測(cè)效率的影響，目的在于提高小腸組織中ILC3檢出頻率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠 均為無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雌性小鼠(月齡3個(gè)月)，體質(zhì)量(20±5)g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2儀器 Gallios流式細(xì)胞儀(美國(guó) Beckman公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，1 mL注射器、1.5 mL、50 mL離心管(北京蘭博利德商貿(mào)有限公司)，200目尼龍紗網(wǎng)、流式細(xì)胞儀試管(美國(guó)BD公司)。

1.1.3試劑 eBioscience公司Transcription Factor Staining Buffer Set破膜劑(貨號(hào)：00-5523-00)，BD公司Cytofix/Cytoperm破膜劑(貨號(hào)：554714)，聯(lián)科生物公司Fix&Perm Kit破膜劑(貨號(hào)：70-GAS003)。抗小鼠Lin-405、抗小鼠CD45-FITC、抗小鼠CD127-PECy7、抗小鼠RORγt-APC購(gòu)自eBioscience公司。3.5%水合氯醛、10×磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉、Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)、5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、膠原酶、Dnase I購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries公司。

1.2方法

1.2.1小腸組織單細(xì)胞懸液制備 取月齡3個(gè)月的實(shí)驗(yàn)小鼠,3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頸處死，剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹腔臟器，用手術(shù)剪在胃與十二指腸連接處、回盲腸連接處剪斷，分離全段小腸置于1%冷PBS中，剝除腸系膜并用1%冷PBS沖洗小腸，剪下小腸派爾集合淋巴結(jié)(PP結(jié))，將小腸置于5～10 mL solution Ⅰ(HBSS+5 mmol/L EDTA+10 mmol/L HEPES)中，37 ℃ 100 r/min搖床中消化15～20 min，重復(fù)4～5次，直至小腸組織呈無(wú)色透明狀，棄上清液并收集小腸組織置于solution Ⅱ(HBSS+2%FBS+0.5 mg/mL膠原酶Ⅱ+0.5 mg/mL膠原酶Ⅲ+0.5 mg/mL DNase Ⅰ)中，再次消化，37 ℃ 100 r/min搖床中消化30 min，重復(fù)2～3次，將小腸組織消化液于200目尼龍紗網(wǎng)中過(guò)濾后，將上清液收集于50 mL離心管中[10]。

1.2.2細(xì)胞染色 將收集的小腸組織單細(xì)胞懸液根據(jù)使用的破膜劑分為3組:eBioscience組(EB組)、BD組、聯(lián)科組(MS組)。每份標(biāo)本中分別加入Lin-405、CD45-FITC、CD127-PECy7進(jìn)行表面染色，冰上避光孵育1 h，3 000 r/min離心1 min，3組標(biāo)本中分別加入不同公司的適量破膜劑，溫度4 ℃，分10、20及60 min 3種不同處理時(shí)間，用配套的破膜洗液洗滌兩遍后，在小腸組織單細(xì)胞懸液標(biāo)本中分別加入RORγt-APC抗體冰上避光染色1 h，染色結(jié)束后分別加入適量配套的破膜洗液洗滌兩遍，2 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3樣品檢測(cè)與分析 開(kāi)啟Gallios流式細(xì)胞儀在前向角散射光(FSC)/側(cè)向角散射光(SSC)散點(diǎn)圖中顯示細(xì)胞群，圈出淋巴細(xì)胞群，利用ISO管、單陽(yáng)管調(diào)節(jié)電壓、補(bǔ)償?shù)葏?shù)。在淋巴細(xì)胞群中，圈出Lin-CD45+CD127+RORγt+的ILC3[11]，利用FlowJo (version 7.6)軟件分析細(xì)胞群比例。

2 結(jié) 果

2.1小鼠小腸ILC3圈門策略 如圖1所示，可見(jiàn)明顯ILC3細(xì)胞群。相同破膜時(shí)間不同組別中小腸ILC3典型圖如圖2所示。將相同破膜時(shí)間不同破膜劑處理的ILC3檢出頻率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)EB組[(19.66±0.33)%]和BD組[(20.73±0.49)%] Lin-CD45+CD127+RORγt+的ILC3檢出率高于MS組[(10.79±0.25)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但BD組和EB組小腸組織中ILC3的檢出頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如圖3所示。

注：A為小腸中淋巴細(xì)胞群分布；B為淋巴細(xì)胞群；C為L(zhǎng)in-細(xì)胞群；D為CD127+RORγt+的ILC3。

2.2破膜時(shí)間對(duì)檢測(cè)小腸中ILC3頻率的影響 3種破膜劑分別對(duì)小腸ILC3處理不同時(shí)間，結(jié)果表明，對(duì)細(xì)胞處理10 min，破膜效果較差，然而破膜60 min，破膜過(guò)度，小腸ILC3檢出頻率低，細(xì)胞形態(tài)受破壞。當(dāng)細(xì)胞處理20 min時(shí)，破膜效果最佳，小腸中ILC3檢出頻率最高。見(jiàn)表1。

注：A為MS組小腸ILC3頻率；B為EB組小腸ILC3頻率；C為BD組小腸ILC3頻率。

注：與MS組比較，*P<0.05；“n.s.”表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 破膜時(shí)間對(duì)3組破膜劑檢測(cè)ILC3細(xì)胞頻率的影響

2.3實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性 在相同實(shí)驗(yàn)條件下，同一份標(biāo)本由不同操作者進(jìn)行，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同一份標(biāo)本由同一操作者重復(fù)2遍，CV值均小于5%。

3 討 論

隨著流式細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于各大實(shí)驗(yàn)室，特別是隨著激光管的不斷增加，熒光素的不斷開(kāi)發(fā)，多色流式細(xì)胞儀的應(yīng)用能夠更加快速準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，例如在檢測(cè)自然殺傷(NK)細(xì)胞和ILC1時(shí)，NK細(xì)胞與ILC1均屬于第一類ILC細(xì)胞，且由于ILCs發(fā)現(xiàn)較晚，ILC1常與NK細(xì)胞相混淆，但由于多色流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)在CD3-NKp46+NK1.1+的基礎(chǔ)上，CD49a+CD49b-的細(xì)胞是ILC1，而CD49a-CD49b+的細(xì)胞是NK細(xì)胞[12]。在原有基礎(chǔ)上，增加兩種熒光素，能夠準(zhǔn)確區(qū)分兩種不同細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞時(shí)，對(duì)于胞內(nèi)抗原染色，細(xì)胞的固定與破膜是否恰當(dāng)將嚴(yán)重影響染色效果，目前常用的破膜劑主要是BD Cytofix/Cytoperm試劑盒、Beckman Coulter試劑盒、eBioscience Fix & Perm試劑盒等，選擇合適的破膜劑，能夠更好地保持細(xì)胞的大小和完整性，增加細(xì)胞膜的通透性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用EB公司的破膜劑和BD公司破膜劑能夠更好的檢測(cè)出小腸中ILC3，在多次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用配套的破膜洗液洗滌細(xì)胞后，能夠有效地減少非特異性結(jié)合，并提高染色效率。但延長(zhǎng)破膜時(shí)間并沒(méi)有提高破膜效率，反而由于破膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞腫脹，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對(duì)于低水平表達(dá)的抗原，在做配色時(shí)，應(yīng)選擇強(qiáng)熒光集團(tuán)，并適當(dāng)增加染色時(shí)間，以提高染色效率，同時(shí)當(dāng)流式標(biāo)本制作完成后，應(yīng)盡快進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，減少細(xì)胞死亡，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本實(shí)驗(yàn)所研究的ILC3屬于第三類ILCs，ILC3分為NKp46+的ILC3和NKp46-的淋巴樣組織誘導(dǎo)細(xì)胞(LTi)[13]，ILC3主要存在于腸道、皮膚黏膜中，受到TCF1、Notch和RUNX1等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[14]。ILC3主要存在于小腸固有層，產(chǎn)生IL-22和IL-17等細(xì)胞因子，對(duì)維持腸道免疫功能發(fā)揮重要作用[14]。在利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小腸中ILC3時(shí)，由于RORγt屬于胞內(nèi)抗原，且抗原表達(dá)水平較低，本實(shí)驗(yàn)室選擇了熒光素較強(qiáng)的APC做配色[15]，同時(shí)選用合適的破膜劑，能夠更好的檢測(cè)小腸內(nèi)ILC3。流式細(xì)胞術(shù)作為一項(xiàng)被廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)仔細(xì)考慮本實(shí)驗(yàn)的配色方案是否合理，并利用少量標(biāo)本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整實(shí)驗(yàn)方法，最終獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)比較不同公司破膜劑對(duì)檢測(cè)小鼠小腸中ILC3頻率的影響，發(fā)現(xiàn)EB公司破膜劑和BD公司破膜劑能提高流式細(xì)胞儀檢測(cè)頻率，同時(shí)驗(yàn)證了增加破膜時(shí)間并不能提高破膜效率。本研究比較了3種不同公司的破膜劑對(duì)檢測(cè)小鼠小腸中ILC3的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。