楊 芩，羅 莉，羅 婭，劉雅蘭，張婷渟，彭 舒

（1凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州556000）（2凱里學(xué)院藍(lán)莓研究所）

自交不親和性為高等植物為了實(shí)現(xiàn)遺傳重組和保持遺傳變異的一種重要機(jī)制[1]，基于遺傳決定方式可分為孢子體自交不親和性（SSI）與配子體自交不親和性（GSI）[2]。SSI的表型由孢子體的S基因型決定，主要表現(xiàn)為花粉在柱頭乳突細(xì)胞表面不能正常萌發(fā)，或萌發(fā)后在柱頭乳突細(xì)胞上彎曲生長(zhǎng)而不能進(jìn)入花柱組織；GSI的表型則是由花粉自身的單倍體基因所決定，主要表現(xiàn)為花粉管通常在花柱組織，或花粉管與胚囊組織間停止生長(zhǎng)[3-4]。前人研究表明，梨[5-6]、蘋果[6-7]、李[8]和枇杷[9]等薔薇科果樹(shù)均屬于 GSI類型。藍(lán)莓屬杜鵑花科越橘屬（Vacciniumspp.）多年生落葉或常綠灌木果樹(shù)[10]，藍(lán)莓大多為自花授粉結(jié)實(shí)率極低或不結(jié)實(shí)，多數(shù)品種具自交不親和性[11-12]。因此，在生產(chǎn)栽培中需多品種搭配建園，以保證坐果和提高產(chǎn)量[13-15]。然而，迄今為止，關(guān)于藍(lán)莓自交不親和性的花粉管動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道。

本研究以‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’2個(gè)品種為試材，開(kāi)展自花和異花授粉，采用熒光顯微觀察方法研究自花和異花授粉后不同時(shí)間花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)至花柱上部、中部和基部的花柱比率，分析自花和異花授粉對(duì)參試品種花粉管動(dòng)力學(xué)的影響，以期為深入認(rèn)識(shí)藍(lán)莓授粉受精生物學(xué)特性及自交不親和生物學(xué)機(jī)制積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以種植于凱里學(xué)院卓越農(nóng)林人才培養(yǎng)實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)5年生的兔眼藍(lán)莓‘園藍(lán)’和北高叢藍(lán)莓‘藍(lán)金’為試材，每個(gè)品種隨機(jī)選取20株生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、長(zhǎng)勢(shì)一致的作為參試植株，異花授粉花粉采自同園內(nèi)5年生的兔眼藍(lán)莓品種‘燦爛’。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1花粉收集與授粉

2018年3月16—29日盛花期，在參試植株樹(shù)冠外圍中上部選取長(zhǎng)勢(shì)一致的中果枝[10]，大蕾期花去雄后，其余花疏掉，然后用尼龍網(wǎng)袋套袋隔離，每個(gè)授粉處理組合共去雄540朵。去雄后第3 d，將2.0 mL的離心管放置于‘園藍(lán)’或‘藍(lán)金’花冠的正下方，用鑷子輕輕碰撞花冠收集花粉[13]，然后鑷子頭蘸滿花粉，輕觸柱頭幾次，進(jìn)行自花授粉，至柱頭表面明顯觀察到花粉為止；采用相同的方法用‘燦爛’的花粉進(jìn)行異花授粉。授粉后立即用尼龍網(wǎng)袋套袋隔離。

1.2.2材料收集與固定

參照枇杷花粉管動(dòng)力學(xué)研究方法[16]，授粉后第2、4、8、12、24、48、72、96、120 h取樣，然后立即用FAA（38%甲醛∶冰醋酸∶70%酒精=5∶5∶90）固定處理，每個(gè)授粉組合采集60朵花，每20朵花為1次重復(fù)，共3次重復(fù)。

1.2.3軟化處理與熒光顯微觀察

按照楊芩等[17]的方法，用解剖刀和解剖針將各授粉組合經(jīng)FAA固定預(yù)處理的花柱和子房分離，分別裝入10 mL的小玻璃瓶中，然后用1 mol/L NaOH溶液在常溫下軟化處理，處理期間每天觀察1次，花柱和胚珠透明后立即用蒸餾水清洗2～3次，然后加入0.1%苯胺藍(lán)染色液染色48 h；染色后的花柱和胚珠壓片，置于OLYMPUS-BX53型熒光顯微鏡下觀察，用DP70攝像頭拍照，統(tǒng)計(jì)分析自花和異花授粉后被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)上部、中部和基部的花柱比率，以及胚囊活力情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理與統(tǒng)計(jì)后，將所有百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件中的SNK檢驗(yàn)在5%水平下進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 自花授粉和異花授粉對(duì)花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)花柱上部的影響

從圖1可以看出，在授粉后2 h或4 h，參試品種無(wú)論是異花授粉還是自花授粉，花粉管均未能生長(zhǎng)至花柱上部。各授粉組合至授粉后8 h均可在花柱上部觀察到花粉管，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’均表現(xiàn)出異花授粉后被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)上部的花柱比率顯著高于自花授粉。隨授粉時(shí)間的延長(zhǎng)，各授粉組合被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)花柱上部的花柱比率均逐漸增加，至授粉后48 h，被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)上部的花柱比率均高于75%，同一品種內(nèi)異花授粉中被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)上部的花柱比率顯著高于自花授粉。在授粉后72～120 h，被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)上部的花柱比率同品種自花和異花授粉組合間差異不顯著。在授粉后120 h，各授粉組合被花粉管生長(zhǎng)至花柱上部的花柱比率均達(dá)到98%。

2.2 自花授粉和異花授粉對(duì)花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)花柱中部的影響

圖1 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h花粉管生長(zhǎng)至花柱上部的比率比較

從圖2可以看出，授粉后12 h內(nèi)，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’自花授粉和異花授粉處理未發(fā)現(xiàn)有花粉管能生長(zhǎng)至花柱中部。授粉后24 h，‘園藍(lán)’自花授粉花粉管生長(zhǎng)至中部的花柱比率僅為12%，顯著低于異花授粉的48%；‘藍(lán)金’自花授粉花粉管生長(zhǎng)至中部的花柱比率為22%，顯著低于異花授粉的43%，‘藍(lán)金’自花授粉處理的花粉管生長(zhǎng)至中部的花柱比率顯著高于‘園藍(lán)’的自花授粉。在授粉后72 h，各授粉組合花粉管生長(zhǎng)至中部的花柱比率均在65%以上，異花授粉后花粉管生長(zhǎng)至花柱中部的花柱比率仍顯著高于自花授粉。授粉后96 h，各授粉處理組合花粉管生長(zhǎng)至花柱中部的花柱比率均達(dá)到90%，且至授粉后120 h，各授粉處理組合差異均不顯著。

圖2 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h花粉管生長(zhǎng)至花柱中部的比率比較

2.3 自花授粉和異花授粉對(duì)花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)花柱基部的影響

從圖3可以看出，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’自花授粉和異花授粉后24 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有花粉管生長(zhǎng)至花柱基部。授粉后48 h，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’異花授粉處理觀察到少量花柱基部有花粉管，自花授粉處理的花柱基部均未觀察到花粉管。授粉后72 h，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’異花授粉處理的花柱基部觀察到花粉管的比率均高于60%，自花授粉處理僅有25%左右的花柱基部被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)。值得注意的是，至授粉后120 h，‘藍(lán)金’自花和異花授粉處理的花柱基部被花粉管生長(zhǎng)穿過(guò)的比率無(wú)顯著性差異，均超過(guò)95%；‘園藍(lán)’異花授粉處理花粉管生長(zhǎng)至基部的花柱比率顯著高于自花授粉，自花授粉處理的比率僅為32%，花柱基部為‘園藍(lán)’自花授粉花粉管停止生長(zhǎng)的關(guān)鍵部位。

圖3 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h花粉管生長(zhǎng)至花柱基部的比率比較

2.4 自花授粉和異花授粉后對(duì)花粉管生長(zhǎng)至胚珠的影響

從圖4可以看出，在授粉后72 h，各授粉組合處理均能在胚珠中觀察到花粉管，自花授粉處理‘園藍(lán)’比率為3.33%、‘藍(lán)金’為8.67%，異花授粉處理‘園藍(lán)’為15.33%、‘藍(lán)金’為13.33%，同一品種異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率顯著高于自花授粉。在授粉后96 h，‘園藍(lán)’異花授粉處理30.67%的胚珠中可以觀察到花粉管，顯著高于自花授粉的9.33%；‘藍(lán)金’異花授粉處理29.33%的胚珠中可以觀察到花粉管，顯著高于自花授粉的26.00%。授粉后120 h，‘藍(lán)金’異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率為43.33%，顯著高于自花授粉的34.00%；‘園藍(lán)’異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率為36.67%，顯著高于自花授粉的18.67%。但值得注意的是，‘園藍(lán)’自花授粉處理胚珠中有花粉管的比率僅為18.67%，顯著低于‘藍(lán)金’自花授粉的34.00%。

圖4 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率比較

2.5 自花授粉和異花授粉后對(duì)胚珠有胼胝質(zhì)的影響

從圖5可以看出，在授粉后2 h，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’的自花和異花授粉均有胼胝質(zhì)出現(xiàn)，胚珠中有胼胝質(zhì)的比率為16%～30%，‘園藍(lán)’胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率顯著高于‘藍(lán)金’。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理胚珠出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率逐漸增加。在授粉后48 h，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率分別為47.33%和34.67%；授粉后48～120 h，‘園藍(lán)’自花授粉處理的胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率均顯著高于異花授粉處理，‘藍(lán)金’自花和異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率均差異不顯著。

圖5 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率比較

2.6 自花授粉與異花授粉受精進(jìn)程

熒光顯微觀察圖片（圖6）顯示，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花和異花授粉花粉管在花柱中均有胼胝質(zhì)出現(xiàn)，但自花授粉處理的胼胝質(zhì)明顯多于異花授粉，且自花授粉處理的胼胝質(zhì)主要出現(xiàn)在花柱上部，隨花粉管的生長(zhǎng)，在花柱中部和基部花粉管上附著的胼胝質(zhì)明顯減少。值得關(guān)注的是，‘園藍(lán)’自花授粉的花粉管在花柱基部停止生長(zhǎng)，且花柱基部組織中出現(xiàn)大量的胼胝質(zhì)，而‘園藍(lán)’異花和‘藍(lán)金’自花與異花授粉處理的花粉管均能順利穿過(guò)整個(gè)花柱，同時(shí)2個(gè)品種異花授粉處理的花柱基部未發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)。結(jié)果表明，‘園藍(lán)’自花授粉后表現(xiàn)出典型的配子體自交不親和中的合子前不親和類型，而‘藍(lán)金’自花授粉后未表現(xiàn)出自交不親和性。

圖6 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后120 h花粉管生長(zhǎng)的熒光顯微圖

3 討論與結(jié)論

長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者和藍(lán)莓種植者熟知，高叢藍(lán)莓、兔眼藍(lán)莓和矮叢藍(lán)莓等栽培類型的品種大多具有自交不親和性，自花授粉不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率較低[11,13,18-20]，多品種搭配建園是保證和提高其產(chǎn)量的必要條件[21]，但關(guān)于藍(lán)莓自花和異花授粉對(duì)花粉管動(dòng)力學(xué)影響的研究至今鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉后花粉管均能夠順利地穿過(guò)柱頭乳突細(xì)胞進(jìn)入花柱，且與歐洲李[22]、棗[23]、杏李[24]、草原櫻桃[25]等果樹(shù)授粉不親和現(xiàn)象類似，花粉管在花柱中生長(zhǎng)伴隨大量的胼胝質(zhì)出現(xiàn)。然而，胼胝質(zhì)出現(xiàn)的部位卻有明顯差異，本研究發(fā)現(xiàn)，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉后，胼胝質(zhì)主要附著在處于花柱上部的花粉管上，‘園藍(lán)’花柱基部亦出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)，而棗[23]自花授粉則在花柱基部和子房出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)，杏李[24]自花授粉后則在花柱柱頭、花柱中上部和子房室胚珠附近處有胼胝質(zhì)出現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與歐洲李[22]、棗[23]、杏李[24]、草原櫻桃[25]等果樹(shù)授粉不親和花粉管生長(zhǎng)的規(guī)律不同，‘園藍(lán)’自花授粉后花粉管生長(zhǎng)至花柱上部時(shí)雖附著大量胼胝質(zhì)，但仍能繼續(xù)生長(zhǎng)至花柱中下部，且除了頂端變細(xì)外未出現(xiàn)彎曲和頂端膨大現(xiàn)象，而歐洲李[22]則在花柱中上部出現(xiàn)花粉管彎曲和膨大現(xiàn)象，杏李[24]花粉管進(jìn)入柱頭后出現(xiàn)團(tuán)狀纏繞，并伴有頂端變細(xì)和在花柱中生長(zhǎng)出現(xiàn)回折的現(xiàn)象，梨[26]花粉管在花柱內(nèi)表現(xiàn)為扭曲變形、雜亂無(wú)章和末端變粗膨大等現(xiàn)象，然而最后的結(jié)果是都導(dǎo)致了自花的花粉管停止生長(zhǎng)?！畧@藍(lán)’這種自花花粉管在花柱中停止生長(zhǎng)的現(xiàn)象是否像薔薇科果樹(shù)一樣歸因于自花花粉管中的RNA被花柱S-RNase所降解，或歸因于蛋白激酶和磷酸酯酶之間的相互作用，引起自花花粉發(fā)生程序化死亡，導(dǎo)致花粉管在花柱中停止生長(zhǎng)[27]至今不得而知。因此，藍(lán)莓花粉管在花柱中停止生長(zhǎng)的原因急需闡明，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)藍(lán)莓自交不親和機(jī)制的重要研究方向。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’用‘燦爛’異花授粉的花粉管分別在授粉后48 h和72 h可以生長(zhǎng)至花柱的基部和胚珠，生長(zhǎng)至花柱基部和胚珠所需時(shí)間均長(zhǎng)于李菊馨等[28]在‘密斯蒂’藍(lán)莓授粉親和性研究中發(fā)現(xiàn)的24 h和48 h。這可能歸因于不同品種，或不同發(fā)育時(shí)期自交不親和基因表達(dá)的時(shí)空差異[16,29]。此外，本研究表明，參試品種異花授粉的花粉管生長(zhǎng)速度快于自花授粉，這與‘密斯蒂’[28]自花和異花授粉花粉管生長(zhǎng)速度一致的結(jié)果有差異，但與自花和異花授粉對(duì)‘寒富’蘋果[30]和‘華碩’油茶[31]花粉管動(dòng)力學(xué)的影響結(jié)果一致。這可能歸因于本研究授粉試驗(yàn)在大蕾期去雄，去雄后第3 d授粉時(shí)為自交不親和基因在花柱內(nèi)表達(dá)最強(qiáng)的時(shí)期，從而抑制了自花花粉管的生長(zhǎng)[16,32]。此外，在授粉后72 h，‘園藍(lán)’自花授粉的胚珠出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率顯著高于異花授粉，而‘藍(lán)金’自花授粉的胚珠出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率與異花授粉差異不顯著，這表明自花授粉處理可能加速了胚珠的退化[16]，但具體原因仍有待進(jìn)一步深入研究。