徐引弟，王治方，張青嫻，焦文強，朱文豪，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

豬肺炎支原體是豬支原體肺炎的主要病原。豬支原體肺炎是一種慢性、接觸性傳染病，具有高發(fā)病率和低病死率的特點，主要表現(xiàn)為食欲減退、發(fā)熱、咳嗽、氣喘、呼吸困難等癥狀，患病豬生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率下降，常誘發(fā)其他病原的感染，特別是免疫抑制性病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型，引起免疫抑制誘導(dǎo)，常因同時繼發(fā)細菌感染引起死亡，是世界上最主要的豬病之一[1-3]。

本病廣泛存在于世界各地，持續(xù)感染且難以治愈，同時由于感染豬較高的治療費用并造成生產(chǎn)性能降低，從而給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重危害。目前國內(nèi)外均有豬肺炎支原體毒株的報道，有一些較好的疫苗毒株，各有優(yōu)缺點[4-12]。鑒于此，本研究對從河南本地豬場分離的一株豬肺炎支原體進行了生物學(xué)特性研究，旨在為研制具有安全、免疫原性好疫苗以及為豬支原體肺炎的綜合防制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與參考毒株

毒株分離自2017年4月在河南省濮陽市某大型豬場發(fā)生重癥肺炎呼吸困難的2月齡保育豬的發(fā)生實變的豬的肺臟[13]，命名為HNMhy1，保藏編號：CGMCC NO：13858，保藏日期：2017年5月26日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。參考毒株為豬肺炎支原體J疫苗株，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽傳染病研究室保存。

1.2 主要試劑和酶

PPLO肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉購自美國BD公司產(chǎn)品，葡萄糖、酚紅購自上海國藥集團公司，MEM、馬血清購自美國Hyclone公司，青霉素購自華北制藥集團公司，L-精氨酸購自Roche公司，2×PCR Mix、DL 2 000 Marker、Ezup 柱式動物基因組 DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司。氫氧化鋁佐劑，F(xiàn)5881，購自Sigma公司，豬肺炎支原體ELISA抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司。

1.3 試驗動物

試驗豬為15日齡健康的保育豬，購自河南某豬場，試驗前經(jīng)豬肺炎支原體ELISA抗體檢測試劑盒檢測，結(jié)果均為陰性。

1.4 增殖滴度試驗

將HNMhy1接種PPLO固體培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，轉(zhuǎn)接PPLO液體培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，取100 μL連續(xù)10倍稀釋涂布固體平板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，低倍鏡下活菌計數(shù)，計算培養(yǎng)物原液菌體滴度。

1.5 毒力試驗

試驗豬為21日齡健康的保育豬15頭，試驗動物隨機分為3組，未接毒對照組5頭，HNMhy1株組5頭，J株組5頭。將HNMhy1、J株接種PPLO液體培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，測定菌體滴度，調(diào)整至108CFU/mL，試驗組動物通過氣管注射分別接種3 mL HNMhy1、J株液體培養(yǎng)物，對照組動物通過氣管接種3 mL滅菌的PPLO液體培養(yǎng)基。試驗期為28 d，每天觀察試驗動物的臨床表現(xiàn)，測量體溫、體重，試驗結(jié)束后剖殺所有試驗動物，觀察呼吸道病變，采集肺組織病健交界處，研磨，進行病原菌的分離及PCR鑒定。

1.6 免疫原性試驗

1.6.1 疫苗的制備 將豬肺炎支原體菌株HNMhy1接種到PPLO液體培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后收取培養(yǎng)物，測定濃度，調(diào)整培養(yǎng)物中豬肺炎支原體的菌數(shù)為2×109CFU/mL，每1 000 mL培養(yǎng)物加2 mL甲醛溶液，于37℃滅活12 h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等體積的氫氧化鋁佐劑，混合制得豬肺炎支原體滅活疫苗，疫苗中豬肺炎支原體的菌數(shù)約為1×109CFU/mL。

1.6.2 疫苗的安全性試驗 選取21日齡健康仔豬10頭，均為豬肺炎支原體ELISA抗體陰性。分為2組，每組5頭。疫苗組：頸部肌肉注射10 mL本疫苗；對照組：頸部肌肉注射10 mL滅菌生理鹽水。觀察30 d。

1.6.3 疫苗的效力試驗 選取21日齡健康仔豬15頭，均為豬肺炎支原體ELISA抗體陰性。分為3組，為：HNMhy1株疫苗組、J株疫苗組、空白對照組，每組5頭。疫苗組分別注射疫苗2 mL，空白對照組注射0.5 mL滅菌生理鹽水。疫苗組和空白對照組21 d后二免分別注射同等劑量的疫苗和滅菌生理鹽水。二免后14 d用109CFU的HNMhy1采取氣管注射的攻毒方式進行攻毒。攻毒后28 d內(nèi)，觀察所有豬的臨床癥狀。在攻毒28 d后，對所有豬進行剖檢，觀察肺部病變。

2 結(jié)果與分析

2.1 增殖滴度試驗結(jié)果

HNMhy1接種 PPLO液體培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，低倍鏡下活菌計數(shù)，培養(yǎng)物原液菌體滴度為8.0×109CFU/mL。表明HNMhy1增殖滴度高。

2.2 毒力試驗結(jié)果

試驗組動物在接種支原體HNMhy1和J株后10～15 d有明顯體溫上升趨勢，空白對照組體溫保持相對穩(wěn)定，表明HNMhy1感染動物后，體溫有一定的影響。感染前后體重變化結(jié)果顯示，感染豬的日增重明顯低于空白組，J株增重最為緩慢，結(jié)果表明HNMhy1株感染后，對動物增重有影響。感染豬群在感染后7～14 d逐漸開始表現(xiàn)出口鼻流沫、呼吸困難、咳嗽、喘氣等癥狀，隨時間推移癥狀逐漸加重，減食，張口伸舌、犬坐式腹式呼吸?？瞻讓φ战M動物在試驗期間體溫正常且無明顯的呼吸道病癥狀。試驗結(jié)束后剖殺所有試驗動物，采集病料，進行支原體分離。試驗組剖檢，肺的尖葉、心葉、隔葉部分出現(xiàn)兩側(cè)對稱性“肉樣變”的實變，與周圍組織界限明顯。對照組剖檢均未發(fā)生明顯的病理變化。對照組的5份病料均未分離到支原體，試驗組的5份病料中均分離到豬肺炎支原體，菌落形態(tài)表現(xiàn)為“煎荷包蛋樣”，PCR鑒定結(jié)果與HNMhy1一致。

2.3 免疫原性試驗結(jié)果

2.3.1 安全性試驗結(jié)果 觀察期間，疫苗組和對照組的仔豬均健康活潑，早晚體溫、采食量差異均不顯著，未見精神不振、食欲減退、呼吸困難、嘔吐、俯臥、震顫等不良反應(yīng)。說明本發(fā)明的滅活疫苗安全。

2.3.2 效力試驗結(jié)果 疫苗組與未免疫組仔豬攻毒后有明顯的差異，攻毒后，未免疫組第2天開始出現(xiàn)臨床癥狀，咳嗽、氣喘，呼吸困難、減食；免疫組豬基本正常，無明顯的臨床癥狀。剖檢結(jié)果，免疫組與對照組肺部差異明顯，對照組肺臟尖葉、心葉、隔葉部分出現(xiàn)兩側(cè)對稱性“肉樣變”的實變，與周圍組織界限明顯，而免疫組豬肺組織病變不明顯，說明HNMhy1具有良好的免疫原性。

3 討論

豬肺炎支原體菌株HNMhy1分離自發(fā)生典型呼吸困難、肺臟發(fā)生實變的保育豬，在PPLO液體培養(yǎng)基中增殖滴度高，達109CFU/mL以上。通常支原體的滴度用顏色變化單位（Colour Change Unit,CCU）來測定，由于豬肺炎支原體可代謝葡萄糖而產(chǎn)酸，因此可以導(dǎo)致液體培養(yǎng)基pH發(fā)生變化，加入適當(dāng)?shù)膒H指示劑進行檢驗，便可應(yīng)用于間接測定培養(yǎng)物的活單元。這種方法稱之為顏色變化單位滴度試驗。都是在實際操作中發(fā)現(xiàn)，由于加了酚紅的培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中幾天后顏色會有很大的變化，那么加了支原體的培養(yǎng)基顏色變化不完全是支原體的因素，很多因素對CCU都有影響，而支原體在固體培養(yǎng)基上非常小，必須借助顯微鏡，因此我們在顯微鏡下計數(shù)，更能準確地進行活菌計數(shù)。結(jié)果顯示HNMhy1株的增殖滴度是很高的[6]。

HNMhy1株對保育豬具有較強的致病力，能夠引起保育豬發(fā)生典型的喘氣病癥狀，采用的感染方式是氣管注射，模擬了自然條件下上呼吸道感染的情況，對仔豬的體溫、增重都有明顯的影響，表現(xiàn)出咳嗽氣喘等癥狀并逐漸加重，飼料轉(zhuǎn)化率下降明顯。解剖后肺臟出現(xiàn)明顯的肉樣變化，出現(xiàn)典型的支原體感染的臨床病理變化，結(jié)果表明HNMhy1毒力較強。

HNMhy1株對保育豬具有良好的免疫原性。用豬肺炎支原體菌株HNMhy1制備的疫苗大劑量免疫無不良反應(yīng)、安全，對強毒的攻擊具有較好的保護效果。以上試驗證明，HNMhy1株適合滅活疫苗的候選毒株。