宋 曦，汪 慧，王應(yīng)強(qiáng)，張亞亞

（隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽 745000）

0 引言

果醋是以水果為原料，經(jīng)酒精、醋酸發(fā)酵后形成的一種發(fā)酵飲品[1]。果醋有增進(jìn)食欲、促進(jìn)消化、降低血膽固醇、預(yù)防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病等功效，兼具果蔬的營養(yǎng)功能，富含多種維生素、礦物質(zhì)，使果醋成為了備受青睞的功能型飲品[2-3]。

在果醋發(fā)酵過程中，醋酸菌的性能對產(chǎn)品品質(zhì)有較大的影響，而具有優(yōu)良發(fā)酵性能的耐醇、耐酸菌株選育也成為果醋生產(chǎn)中新的研究熱點[4-6]。野生醋酸菌來源廣泛，自然界中土壤、水果、空氣中均可分離獲得。符楨華[7]研究了用菠蘿棄渣自然發(fā)酵醋酸菌。尚云青[8]以菠蘿皮渣為原料，分別添加AS1.41和滬釀1.01 醋酸菌制作果醋，滬釀1.01 產(chǎn)醋酸性能較好。國內(nèi)從菠蘿皮渣中分離醋酸菌并應(yīng)用到果醋發(fā)酵中的研究較少，多使用商品用菌株，主要原因為野生菌株發(fā)酵性能較差。菠蘿在消費過程中產(chǎn)生大量棄渣，經(jīng)自然放置一段時間后可富集周圍環(huán)境中的醋酸菌，從中分離篩選醋酸菌，以期獲得能夠應(yīng)用于果醋發(fā)酵工業(yè)的性能優(yōu)良的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

菠蘿皮渣（市售，產(chǎn)地：海南）.

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、酵母膏、甘油、乙醇95%、CaCO3、酚酞指示劑（0.5%）、（NH4）2SO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、乙酸鈣、乳酸鈣、濃硫酸、瓊脂、斐林試劑、溴酚藍(lán)水溶液（0.04%）、FeCl3、草酸銨、結(jié)晶紫染液、碘液、番紅染液、碘化鉀、0.1 mol/L NaOH溶液。

1.1.3 儀器和設(shè)備

JJ-200 型電子天平、YXQ-LS-40S11 型立式蒸汽壓力滅菌器、SPA-150B 型生化培養(yǎng)箱、XSP-2CA型生物顯微鏡、 BCD-206STPH 型海爾冰箱、JB-HS-1300U 型潔凈工作臺、離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、分光光度計等。

1.1.4 培養(yǎng)基[9]

（1） 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 值4.5，于121 ℃下滅菌20 min 后備用，使用前添加4%Vol 無水乙醇。

（2） 碳酸鈣平板分離培養(yǎng)基?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入瓊脂2%，CaCO32%，于121 ℃下滅菌20 min，待溫度冷卻至55 ℃后加入無水乙醇3%Vol，搖勻傾倒于無菌培養(yǎng)皿中。

（3） 醋酸菌斜面保藏培養(yǎng)基。酵母膏1%，葡萄糖1%，瓊脂2%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，分裝于試管中，于121 ℃下滅菌20 min，溫度冷卻至55 ℃后加入無水乙醇3%Vol，擺成斜面即可。

（4） 生理生化鑒定培養(yǎng)基。Horyer-Frateur 培養(yǎng)基、GYC（葡萄糖- 酵母膏- 碳酸鈣） 培養(yǎng)基生酮培養(yǎng)基、產(chǎn)5- 酮基葡萄糖酸鹽試驗培養(yǎng)基、產(chǎn)葡萄糖酸試驗培養(yǎng)基、乙酸氧化試驗培養(yǎng)基、乳酸氧化試驗培養(yǎng)基、氧化乙醇試驗培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 醋酸菌分離篩選流程

原材料→增殖培養(yǎng)→菌種分離→革蘭氏染色→產(chǎn)醋酸定性試驗→菌株初篩→菌種復(fù)篩→生理生化試驗。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

菠蘿皮渣在室溫下放置1 周自然發(fā)酵，稱取10 g自然發(fā)酵液，置入盛有100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，于32 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.3 樣品稀釋培養(yǎng)

取1 mL 增殖培養(yǎng)液置于99 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，然后吸取1 mL 稀釋液到9 mL 無菌生理鹽水的試管中，依次梯度稀釋，獲得最終含量為1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8的稀釋液。用移液槍準(zhǔn)確吸取各梯度稀釋液1 mL 于無菌培養(yǎng)皿中，并傾注CaCO3平板分離培養(yǎng)基，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑選菌落形態(tài)一致、有透明圈的單菌落。

1.2.4 菌種純化

挑取以上培養(yǎng)的目的單菌落，在CaCO3平板分離培養(yǎng)基上多次劃線分離純化，并接種于斜面保藏培養(yǎng)基上。

1.2.5 菌株的初篩[10]

對分離菌株所產(chǎn)透明圈直徑進(jìn)行比較。然后從分離培養(yǎng)基上挑取菌落形態(tài)一致、H/C 值（透明圈直徑與菌落直徑的比值） 較大的單菌落，進(jìn)行下一步研究。

1.2.6 革蘭氏染色

將初篩得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.7 產(chǎn)醋酸定性試驗

參考杜連祥[11]的方法。

1.2.8 菌種復(fù)篩

將初篩得到的菌種接種于產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，每株菌做3 個平行，在32 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)72 h，產(chǎn)酸量高的菌株為復(fù)篩得到的菌株。

1.2.9 生理生化試驗[12-14]

接觸酶的試驗、GYC 培養(yǎng)基產(chǎn)色素試驗、單一氮源生長試驗、產(chǎn)5- 酮基葡萄糖酸鹽試驗、產(chǎn)葡萄糖酸試驗、產(chǎn)纖維素試驗、氧化乙酸能力試驗、氧化乳酸的試驗、氧化乙醇試驗、甘油生酮試驗、發(fā)酵葡萄糖試驗。

1.2.10 產(chǎn)醋酸量的測定

參考姜曉芝等人[15]的方法。

1.2.11 產(chǎn)醋酸量隨時間變化曲線

將醋酸菌接種于50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在發(fā)酵12，24，36，48，60，72，84，96，108，120 h 測定各菌的產(chǎn)醋酸量，做3 個平行，繪制各菌株的產(chǎn)醋酸量隨時間變化曲線。

1.2.12 醋酸菌生長量的測定

將醋酸菌接種于50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h 后，分別在13，14，15，16，17，18，19，20，21，22 h測定菌種的生長情況，做3 個平行，繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩

從菠蘿殘渣中分離醋酸菌，選取在CaCO3分離平板培養(yǎng)基上有透明圈的菌株作為研究對象，共得到4 株菌，分別標(biāo)記為B1，B2，B3，B4，對以上4 株菌分別進(jìn)行革蘭氏染色，B1為革蘭氏陽性桿菌；B2，B3，B4為革蘭氏陰性桿菌；將3 株革蘭氏陰性桿菌分離純化，保藏于斜面試管。

2.2 產(chǎn)醋酸定性試驗結(jié)果

對接種B2，B3，B4菌種的發(fā)酵液進(jìn)行產(chǎn)酸定性試驗，在發(fā)酵液中加入5%FeCl3溶液后，3 個菌種發(fā)酵液中均有紅褐色沉淀產(chǎn)生。

產(chǎn)醋酸定性試驗結(jié)果見圖1。

由圖1 可知，初篩得到的3 株微生物經(jīng)恒溫振蕩培養(yǎng)后均能產(chǎn)生一定量的醋酸，醋酸與FeCl3結(jié)合，形成紅褐色沉淀。結(jié)合革蘭氏染色試驗結(jié)果，確定初篩分離到的細(xì)菌為產(chǎn)醋酸細(xì)菌，具體菌屬可根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果判定。

2.3 菌種復(fù)篩

將初篩得到的3 株菌分別進(jìn)行發(fā)酵試驗，在發(fā)酵72 h 后測定發(fā)酵液中醋酸含量，結(jié)果為B2菌種在發(fā)酵72 h 時產(chǎn)醋酸量僅為0.37 g/100 mL，B3產(chǎn)醋酸酸量為0.9 g/100 mL，B4產(chǎn)醋酸量為0.83 g/100 mL。說明B2發(fā)酵產(chǎn)醋酸能力較弱，B3，B4產(chǎn)醋酸能力較強(qiáng)，可達(dá)到B2產(chǎn)醋酸量的2 倍以上。根據(jù)初篩得到微生物產(chǎn)醋酸能力，B3，B4相對產(chǎn)醋酸量高，將其作為進(jìn)一步研究對象。

2.4 生理生化試驗結(jié)果

對B3，B4分別進(jìn)行生理生化試驗。

B3，B4部分生理生化鑒定結(jié)果見表1。

生理生化鑒定結(jié)果表明，復(fù)篩得到的2 株產(chǎn)醋酸細(xì)菌性能基本相同，僅GYG 培養(yǎng)產(chǎn)色素試驗結(jié)果有差別，B3試驗結(jié)果為陽性，B4試驗結(jié)果為陰性；在甘油生酮試驗中，2 株細(xì)菌均產(chǎn)生沉淀，但B3試驗產(chǎn)生的沉淀較多，B4試驗產(chǎn)生的沉淀較少；其他生理生化試驗結(jié)果基本相同。

表1 B3，B4 部分生理生化鑒定結(jié)果

B3，B42 株菌在革蘭氏染色后觀察到其細(xì)胞形狀均為桿狀，無球桿狀，革蘭氏陰性，且在培養(yǎng)基上不產(chǎn)生水溶性色素，菌苔光滑，發(fā)酵葡萄糖試驗為陰性，在pH 值為4.5 的液體培養(yǎng)基中可以生長，并可氧化乙酸產(chǎn)生CO2，通過菌種形態(tài)和生理生化試驗結(jié)果，察看《常見細(xì)菌鑒定手冊》可確定分離得到的產(chǎn)酸細(xì)菌為醋酸桿菌屬，該結(jié)論與前期產(chǎn)醋酸定性試驗結(jié)果相符，對其發(fā)酵過程中產(chǎn)醋酸量進(jìn)行測定，以確定其在有氧發(fā)酵條件下產(chǎn)醋酸的最佳發(fā)酵時間。

2.5 產(chǎn)醋酸量試驗結(jié)果

將B3和B4在相同條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，對培養(yǎng)過程中產(chǎn)醋酸量進(jìn)行測定。

B3，B4產(chǎn)醋酸量隨時間變化圖見圖2。

隨著培養(yǎng)時間的增加，分離菌株產(chǎn)醋酸量先升高后降低，B3，B4菌株產(chǎn)醋酸量在32 ℃培養(yǎng)84 h 達(dá)到最高，產(chǎn)醋酸量分別為1.12 g/100 mL 和1.2 g/100 mL；84 h 后2 株菌的產(chǎn)醋酸量均大幅降低，B3產(chǎn)酸量降低38.4%，B4產(chǎn)醋酸量降低41.7%；菌株之間產(chǎn)醋酸量差異較小，在84 h 時B4產(chǎn)醋酸量比B3僅高0.08 g/100 mL。于32 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)B3產(chǎn)醋酸量差異顯著（p＜0.05），B4產(chǎn)醋酸量差異極顯著（p＜0.01）。可見B3，B4菌株在溫度32 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的發(fā)酵條件下，培養(yǎng)84 h 達(dá)到產(chǎn)酸量高峰。微生物發(fā)酵過程中多種因素影響其產(chǎn)物產(chǎn)量，對于好氧菌株而言主要為發(fā)酵的溫度和需氧量，種子的種齡、培養(yǎng)基的成分對其也有影響。研究中對復(fù)篩菌株在醋酸菌一般發(fā)酵條件下培養(yǎng)，之后可優(yōu)化其發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基，提高菌株產(chǎn)醋酸量。

2.6 菌株的生長曲線

B3，B4菌株生長曲線見圖3。

根據(jù)OD 值結(jié)果繪制B3，B4菌株的生長曲線，可判定菌株B3的對數(shù)生長期為培養(yǎng)12～17 h，之后生長緩慢開始衰亡，在17 h 時OD600值達(dá)到0.37；菌株B4的對數(shù)生長期為培養(yǎng)12～20 h，之后迅速進(jìn)入衰亡期，在19h 時OD600值達(dá)到0.36；菌株B3在溫度32 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)中生長曲線結(jié)果差異顯著（p＜0.05），B4生長曲線結(jié)果差異極顯著（p＜0.01）。采用培養(yǎng)基濁度測定微生物生長曲線方法較為簡便，在測定后期結(jié)果可能出現(xiàn)誤差，這是因為隨著微生物培養(yǎng)時間的延長，一部分微生物在培養(yǎng)過程中衰亡、細(xì)胞裂解，且有起酵現(xiàn)象，導(dǎo)致培養(yǎng)基濃度增加，也就是從培養(yǎng)21 h 后生長曲線有增長現(xiàn)象[16]。在具體生產(chǎn)過程中，可采用平板計數(shù)法，能更準(zhǔn)確地測定培養(yǎng)液中微生物活細(xì)胞數(shù)量。

3 結(jié)論

菠蘿果肉營養(yǎng)價值豐富，菠蘿棄渣作為菠蘿產(chǎn)業(yè)的下腳料，合理利用既可以降低生產(chǎn)成本，又可以減少環(huán)境污染[17-18]。從自然腐敗的菠蘿中分離到醋酸菌，經(jīng)初篩、產(chǎn)醋酸定性試驗、復(fù)篩共得到2 株醋酸細(xì)菌，分別標(biāo)記為B3，B4。對分離的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，確定其為醋酸桿菌屬，對其發(fā)酵性能進(jìn)行研究表明，B3，B4菌株產(chǎn)醋酸量于溫度32 ℃，于轉(zhuǎn)速150 r/min 下恒溫振蕩培養(yǎng)84 h 達(dá)到最高值，產(chǎn)醋酸量分別為1.12 g/100 mL 和1.2 g/100 mL；由生長曲線可判定菌株B3的對數(shù)生長期為培養(yǎng)12～17 h，菌株B4的對數(shù)生長期為培養(yǎng)12～20 h，之后迅速進(jìn)入衰亡期。對已篩選的菌株后期可通過發(fā)酵條件優(yōu)化和誘變育種提高其發(fā)酵能力，并應(yīng)用到實際果醋生產(chǎn)中。