植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿的工藝優(yōu)化及其抗氧化能力

茍擁軍，王 雪，劉 梁，呂鵬軍，孟永宏

（1.西安市長(zhǎng)安區(qū)氣象局，陜西 西安 710100；2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

蘋果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含多種維生素和多酚等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防冠心病等多種功效[1]。我國(guó)蘋果年產(chǎn)量約4 000 萬t，居全球首位[2]，但是近4 年來平均每年加工量約為生產(chǎn)量的20%，產(chǎn)品單一，多以濃縮蘋果汁為主。蘋果加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，其綜合利用水平低，不僅造成了資源浪費(fèi)、效益流失，而且還污染環(huán)境，甚至影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[3]。因此，發(fā)展蘋果多元化加工，對(duì)調(diào)整和優(yōu)化蘋果產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展、滿足廣大消費(fèi)者需求顯得尤為迫切[4-5]。植物乳桿菌是從傳統(tǒng)的植物性發(fā)酵食品中分離篩選出來的一類乳酸菌，其在食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵和醫(yī)療保健領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用[3]。目前，研究發(fā)現(xiàn)利用植物乳桿菌發(fā)酵果蔬，可以有效轉(zhuǎn)化多酚的組成、提高其抗氧化性，從而提高生物利用度[6-7]。

近年來，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者在利用植物乳桿菌發(fā)酵蘋果開發(fā)針對(duì)蛋白敏感人群、素食主義者的乳酸菌補(bǔ)充劑和聚集果蔬精華與乳酸菌保健功能為一體的新型發(fā)酵制品方面進(jìn)行了大量的研究[8]。李維妮等人[9]利用混菌發(fā)酵蘋果汁，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，得到了活菌數(shù)8.3 lg（CFU/mL），感官評(píng)分為80.23 分的蘋果汁飲料。王昕悅等人[10]利用單菌或混菌短時(shí)間發(fā)酵蘋果濃縮汁，獲得具有獨(dú)特風(fēng)味、多元化的發(fā)酵蘋果濃縮汁飲料。李帥等人[11]以蘋果渣和復(fù)原乳為原料，優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝條件后，生產(chǎn)出風(fēng)味純正的固體復(fù)合發(fā)酵乳飲料。Dimotrovski D 等人[12]在添加有乳清的蘋果汁中進(jìn)行植物乳桿菌發(fā)酵，研制出在30 d 內(nèi)活菌數(shù)仍能保持為6.0 lg（CFU/mL） 的新型蘋果汁飲料。目前，對(duì)乳酸菌發(fā)酵的研究主要以蘋果汁為原料，而通過乳酸菌直接發(fā)酵蘋果漿，可以高效利用蘋果資源，解決蘋果資源浪費(fèi)和污染環(huán)境問題。因此，以活菌數(shù)為指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)植物乳桿菌直接發(fā)酵蘋果漿的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并分析蘋果漿發(fā)酵前后多酚和抗氧化活性的變化，研究發(fā)酵對(duì)蘋果漿營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的調(diào)控規(guī)律，從而為開發(fā)新型的健康果蔬產(chǎn)品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“秦冠”蘋果，購于陜西禮泉，要求大小均一、無病害或腐爛、無機(jī)械損傷；植物乳桿菌WCFS1，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；MRS 肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；甲醇（色譜純，純度＞99.99%），美國(guó)Tedia 公司提供；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；WZS80 型手持式糖度計(jì)，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV2600A 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海） 有限責(zé)任公司產(chǎn)品；1260 Infinity II 型液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品；3k30 型超高速低溫離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿的工藝

按以下工藝流程進(jìn)行植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿，并確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1） 護(hù)色。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%氯化鈣和0.5%抗壞血酸溶液護(hù)色之后進(jìn)行打漿處理。

（2） 調(diào)糖、調(diào)酸。使用濃縮蘋果汁調(diào)節(jié)蘋果漿至適宜糖度，蘋果漿初始pH 值為3.3 左右，用食品級(jí)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蘋果漿pH 值到適當(dāng)值，調(diào)節(jié)過程中不斷攪拌，以保證蘋果漿混勻。

（3） 殺菌。錐形瓶分裝蘋果漿，煮沸3 min，迅速冷卻至30 ℃。

（4） 接種。將冰箱保存的植物乳桿菌接種于斜面固體培養(yǎng)基上，溫度30 ℃，時(shí)間24 h，取1 環(huán)菌種接種于100 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基，于30 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，離心去上清液，收集菌體。用生理鹽水懸浮制成約7.0 lg（CFU/mL） 的菌懸液。以5%的接種量接種至蘋果漿中，間隔8 h 取樣，測(cè)定理化指標(biāo)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

參照1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿的工藝流程，分別選取蘋果漿的初始糖度（11，12，13，14，15°Bx）、初始pH 值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5） 和發(fā)酵溫度（28.0，30.0，32.5，35.0，37.0 ℃） 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選取活菌數(shù)最大為優(yōu)化的量化判斷指標(biāo)，探究植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿的最適條件。其具體條件如下：

（1） 初始糖度的確定。設(shè)定植物乳桿菌接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度32.5 ℃，初始pH 值4，初始糖度為11，12，13，14，15°Bx。

（2） 初始pH 值的確定。設(shè)定植物乳桿菌接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度32.5 ℃，初始糖度13 °Bx，初始pH 值為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5。

（3） 發(fā)酵溫度的確定。設(shè)定植物乳桿菌接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h，初始糖度13 °Bx，初始pH 值4，發(fā)酵溫度為28.0，30.0，32.5，35.0，37.0 ℃。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化蘋果漿發(fā)酵試驗(yàn)條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box Behnken模型，以初始糖度（A）、初始pH 值（B） 和發(fā)酵溫度（C） 為自變量；（分別以-1，0，+1 代表自變量的低、中、高3 個(gè)水平，即初始糖度13，14，15°Bx；初始pH 值3.5，4.0，4.5；發(fā)酵溫度30.0，32.5，35.0 ℃），以植物乳桿菌活菌數(shù)為響應(yīng)值，選擇蘋果漿發(fā)酵的最佳條件。

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定

（1） pH 值測(cè)定。采用精密pH 計(jì)測(cè)定。

（2） 可溶性固形物測(cè)定。利用手持式糖度計(jì)測(cè)定。

（3） 活菌數(shù)的測(cè)定。依據(jù)GB 4789.35—2016《乳酸菌檢驗(yàn)》[13]的梯度稀釋平板計(jì)數(shù)方法。選擇2～3 個(gè)適宜稀釋度，在MRS 瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布，每個(gè)稀釋度分別做2 個(gè)平行。將涂布完成的培養(yǎng)基于30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h 后計(jì)數(shù)。

1.3.6 蘋果多酚的測(cè)定

根據(jù)齊娜等人[14]高效液相色譜法（HPLC） 測(cè)定發(fā)酵蘋果漿中的多酚含量。首先對(duì)發(fā)酵蘋果漿提取，然后取10 μL 進(jìn)行HPLC 分析，與多酚標(biāo)品進(jìn)行對(duì)比分析。

（1） 游離態(tài)多酚的提取。參考王耀紅等人[15]的方法。取10 mL 發(fā)酵前后的蘋果漿樣品，分別和甲醇以1∶3（V/V） 于錐形瓶中混勻，用保鮮膜封口，于50 ℃，360 W 的條件下超聲提取40 min。抽濾后，將濾液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，加甲醇（色譜純） 溶液定容至10 mL 棕色容量瓶，用0.45 μm濾膜過濾得到游離多酚提取液。

（2） 結(jié)合態(tài)多酚的提取。參考史江穎等人[16]的方法。將上述充分提取游離態(tài)多酚后的殘?jiān)Q取1 g，加入濃度為2 mol/L 的氫氧化鈉溶液4 mL，常溫超聲提取1 h 后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min，取上清液用濃度為6 mol/L 的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值為4.0，加甲醇（色譜純） 定容至10 mL 容量瓶，用0.45 μm 濾膜過濾即得結(jié)合態(tài)多酚提取液。

（3） 色譜條件。Welchrom-C18柱（4.6mm×150mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測(cè)器波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相：100%甲醇溶液（A） - 0.3%冰乙酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～20 min，0～20.0% A，100.0%～80.0% B；20～40 min，20.0% A，80.0% B；40～41 min，20.0%～30.0% A，80.0%～70.0% B；41～50 min，30.0% A，70.0% B；50～51 min，30.0%～35.0% A，70.0%～65.0% B；51～60 min，35.0% A，76.0% B；60～61 min，35.0%～45.0% A，65.0%～55.0% B；61～70 min，45.0% A，55.0% B；70～71 min，45.0%～55.0% A，55.0%～45.0%B；71～80 min，55.0%A，45.0%B；80～81 min，55.0%～10.0%A，45.0%～90.0%B；81～90 min，10.0%A，90.0% B。

1.3.7 蘋果漿抗氧化活性測(cè)定

（1） 蘋果漿對(duì)DPPH 自由基的清除作用[17]。將蘋果漿以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心處理15 min 后，取0.1 mL 上層清液加入現(xiàn)配制的3.9 mL DPPH 甲醇溶液（0.025 g/L） 避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定樣品吸光度A1。以甲醇為空白測(cè)定吸光度A0，平行3 次，清除率按以下公式（1） 計(jì)算：

式中：A0——空白的吸光度；

A1——樣品的吸光度。

（2） 蘋果漿對(duì)ABTS 自由基的清除作用[18]。取濃度為7 mmol/L 的ABTS 溶液25 mL 和濃度為140 mmol/L的過硫酸鉀溶液440 μL 混勻，室溫下避光反應(yīng)16 h，制成ABTS 工作液。將避光16 h 后的ABTS 工作液與乙醇按1∶49（V/V） 的比例稀釋。蘋果漿以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心處理15 min 后，取上層清液0.1 mL 加入3.9 mL 處理后的ABTS 工作液，于黑暗處反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定樣品吸光度A1。以乙醇替代樣品測(cè)定吸光度A0。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。清除率按以下公式（2） 計(jì)算：

式中：A0——空白的吸光度；

A1——樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin 9.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和制圖，用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件檢驗(yàn)分析比較各試驗(yàn)組間均值差異顯著性（p＜0.05），用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿的單因素試驗(yàn)

在植物乳桿菌接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h 條件下，研究初始糖度、初始pH 值和發(fā)酵溫度對(duì)蘋果漿發(fā)酵活菌數(shù)的影響。

初始糖度（a）、初始pH 值（b）、發(fā)酵溫度（c）對(duì)蘋果漿發(fā)酵過程中活菌數(shù)的影響見圖1。

2.1.1 發(fā)酵初始糖度的確定

糖分是微生物生長(zhǎng)繁殖的主要能量來源，對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿產(chǎn)生重要的影響。如圖1（a）所示，在不同初始糖度的發(fā)酵條件下，初始活菌數(shù)基本一致，且隨著糖度的升高，活菌數(shù)逐漸提高。其中，糖度13，14，15 °Bx 的蘋果漿活菌數(shù)增長(zhǎng)速度較快，且在40 h 后變化不明顯，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，糖度為14 °Bx 的蘋果漿中的活菌數(shù)最高。同時(shí)，在發(fā)酵過程中pH 值的變化不顯著，基本保持在3.5～4.5。綜上所述，選取發(fā)酵糖度為13，14 ，15 °Bx 作為下一步工藝優(yōu)化的3 個(gè)水平。

2.1.2 發(fā)酵初始pH 值的確定

在發(fā)酵過程中，pH 值不僅是微生物生長(zhǎng)的重要的狀態(tài)參數(shù)，同時(shí)也是衡量乳酸菌發(fā)酵周期的重要指標(biāo)，初始pH 值對(duì)產(chǎn)酸速度有著重要的影響。如圖1（b） 所示，隨著pH 值的升高，蘋果漿乳酸發(fā)酵的活菌數(shù)逐漸上升，其中初始pH 值為3.5，4.0，4.5的蘋果漿在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的活菌數(shù)高于其他2 種條件下的蘋果漿。主要原因是當(dāng)微生物的適宜生長(zhǎng)pH 值范圍遭到破壞后，微生物的生長(zhǎng)就會(huì)被抑制[19]。同時(shí)，調(diào)節(jié)蘋果漿初始pH 值為3.5，4.0，4.5 時(shí)，可溶性固形物含量逐漸降低。綜上所述，初始選取pH 值為3.5，4.0，4.5 作為下一步工藝優(yōu)化的3 個(gè)水平。

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度與微生物的生長(zhǎng)密切相關(guān)，微生物生長(zhǎng)是一系列復(fù)雜生化反應(yīng)的結(jié)果，改變發(fā)酵溫度也影響體內(nèi)所進(jìn)行的許多生化反應(yīng)，從而對(duì)生長(zhǎng)速率產(chǎn)生影響。因此，研究發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)至關(guān)重要。如圖3（c） 所示，升高溫度，微生物的生長(zhǎng)速率會(huì)提升，但是過高的溫度對(duì)發(fā)酵速率并無明顯的促進(jìn)，其中發(fā)酵溫度為32.5 ℃的蘋果漿的活菌數(shù)較高，這可能是溫度過低或過高會(huì)影響酶的活性，從而影響菌體生長(zhǎng)[20]；同時(shí)，在不同發(fā)酵溫度下，pH 值和可溶性固形物含量都不斷下降，最終保持恒定。綜上所述，選取發(fā)酵溫度為30.0，32.5，35.0 ℃作為下一步工藝優(yōu)化的3 個(gè)水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿的條件

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

以1.3.4 中的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿工藝優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

利用Design－Expert 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，分別獲得乳酸菌活菌（Y） 對(duì)3 個(gè)自變量初始糖度（A）、初始pH 值（B）、發(fā)酵溫度（C） 的多元回歸方程：

2.2.2 方差分析

對(duì)2.2.1 中的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中得出的回歸方程進(jìn)行方差分析。

方差分析結(jié)果（活菌數(shù)為響應(yīng)值） 見表2。

由表2 可知，模型p＜0.01，說明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型差異極顯著。失擬項(xiàng)p＞0.05（p=0.955 8），差異不顯著。模型決定系數(shù)R2=0.991 7，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2adj=0.981 1，說明植物乳桿菌活菌數(shù)的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度。并且該模型說明初始糖度（A）、發(fā)酵溫度（C）、BC 及二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)蘋果漿活菌數(shù)的影響極顯著，初始pH 值（B）及AB，AC 對(duì)活菌數(shù)的影響不顯著。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果（活菌數(shù)為響應(yīng)值）

2.2.3 因素間交互作用分析

為探究初始糖度、初始pH 值和發(fā)酵溫度這3 個(gè)因素之間的交互作用對(duì)蘋果漿發(fā)酵的影響，對(duì)其響應(yīng)面曲線及等高線圖進(jìn)行分析，從而確定各個(gè)因素的最佳水平。

兩因素交互作用對(duì)活菌數(shù)的影響見圖2。

圖2 （a） 中，發(fā)酵溫度固定在零水平時(shí)，活菌數(shù)隨著初始糖度的升高而增加，達(dá)到最大值后呈下降趨勢(shì)，隨著初始pH 值的升高先增加，隨后呈下降趨勢(shì)，坡度較緩，同時(shí)等高線圖呈現(xiàn)圓形，表明初始糖度與初始pH 值的交互作用不顯著。圖2（b）中，初始糖度固定在零水平時(shí)，隨著初始pH 值和發(fā)酵溫度的升高，活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，同時(shí)響應(yīng)面坡度較緩，等高線圖類似于圓形，這表明初始糖度和發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。圖2（c）中，隨著初始pH 值和發(fā)酵溫度的提升，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)，當(dāng)初始pH 值和發(fā)酵溫度都增大到一定程度時(shí)，蘋果漿發(fā)酵的活菌數(shù)達(dá)到最大值，而當(dāng)兩者繼續(xù)增加時(shí)，活菌數(shù)卻降低，單獨(dú)提高初始pH 值或發(fā)酵溫度，都不會(huì)使活菌數(shù)達(dá)到最大。因此，只有初始pH 值和發(fā)酵溫度在適當(dāng)值時(shí)，才能使發(fā)酵結(jié)束時(shí)的活菌數(shù)最高。由此說明，初始pH 值和發(fā)酵溫度的交互作用顯著。

2.2.4 發(fā)酵工藝條件驗(yàn)證

通過Design-Expert 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件聯(lián)合求解模型方程得出蘋果漿發(fā)酵的最優(yōu)條件為初始糖度14.31 °Bx，初始pH 值4.39，發(fā)酵溫度33.21 ℃，當(dāng)蘋果漿發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到8.76 lg（CFU/mL）?？紤]到實(shí)際操作條件，將蘋果漿發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化為初始糖度14°Bx，初始pH 值4.4，發(fā)酵溫度33.2 ℃，檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化法得到結(jié)果的可靠性。

蘋果漿發(fā)酵過程中pH 值、初始糖度、植物乳桿菌活菌數(shù)的變化見圖3。

由圖3 可知，pH 值總體呈下降趨勢(shì)，初始糖度無顯著變化，活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)。原因可能是植物乳桿菌在發(fā)酵8 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可能是植物乳桿菌迅速生長(zhǎng)繁殖，分解糖類物質(zhì)產(chǎn)生大量乳酸，使得蘋果漿的pH 值迅速降低，活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，pH 值下降至3.57，活菌數(shù)從5.69 lg（CFU/mL） 增加到8.56 lg（CFU/mL），這與模型預(yù)測(cè)值誤差為2.28%，說明該模型的預(yù)測(cè)性較好，優(yōu)化的發(fā)酵工藝可靠。

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿對(duì)游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚的影響

酚類物質(zhì)是植物通過戊糖酸途徑，莽草酸酯途徑和苯丙素途徑產(chǎn)生的次級(jí)代謝物，是果蔬中最重要的功能性成分[21]，酚類物質(zhì)按其形態(tài)可將其分為游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚。蘋果中結(jié)合態(tài)多酚與纖維、果膠等生物大分子結(jié)合后會(huì)使酚羥基被隱藏，在胃、小腸等上消化道內(nèi)無法被直接吸收利用，只有進(jìn)入結(jié)腸后，在腸道微生物的參與下發(fā)生轉(zhuǎn)化，釋放為游離多酚或降解為小分子酚酸，從而發(fā)揮其生理活性[22]。

對(duì)照品和蘋果漿中多酚的HPLC 色譜圖見圖4，蘋果漿發(fā)酵對(duì)游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚的影響見圖5。

通過比對(duì)樣品色譜峰和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，確定了發(fā)酵前后蘋果漿中游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚的變化，如圖5（a） 所示，對(duì)于游離態(tài)多酚，除槲皮素外，其余多酚的種類和含量都發(fā)生了顯著性（p＜0.01） 變化。其中，沒食子酸的比例從1.13%升到8.17%，綠原酸的比例從11.53%升到18.51%，蘆丁的比例從1.75%升到2.33%，槲皮素的比例幾乎不變約占1.3%，表兒茶素和槲皮苷全部消失，根皮素小幅度增加；如圖5（b） 所示，對(duì)于結(jié)合態(tài)多酚，沒食子酸的比例減少了1.18%，表兒茶素的比例減少了35.1%，結(jié)合態(tài)蘆丁和槲皮素全部消失。結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿后游離多酚含量顯著提高，其原因可能在于乳酸菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生某些特殊酶類（如淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶），水解與結(jié)合態(tài)多酚相連的多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，進(jìn)而將結(jié)合態(tài)多酚轉(zhuǎn)化為游離態(tài)多酚。因此，蘋果漿中游離態(tài)多酚含量上升，而結(jié)合態(tài)多酚含量降低。試驗(yàn)結(jié)果與賴婷等人[23]利用7 種不同乳酸菌發(fā)酵桂圓肉研究及Wu S C 等人[24]利用3 種不同乳酸菌（植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和擬干酪乳桿菌） 發(fā)酵對(duì)石蓮花多酚含量變化的結(jié)果相似，表明植物乳桿菌發(fā)酵后，游離態(tài)多酚含量增加最多，釋放結(jié)合態(tài)多酚能力最強(qiáng)，由此可見由植物乳桿菌可以改善多酚組成，提高果蔬的生物活性。

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿對(duì)抗氧化性的影響

蘋果多酚具有多種生理活性，其中抗氧化能力約是維E 的50 倍，維C 的20 倍。多酚含量的變化會(huì)影響其體外抗氧化活性。因此，在已證明植物乳桿菌發(fā)酵果漿中結(jié)合態(tài)多酚含量減少，游離態(tài)多酚含量增加之后，試驗(yàn)進(jìn)一步通過比較發(fā)酵前后蘋果漿對(duì)DPPH 和ABTS 自由基的清除率，探究植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)蘋果漿抗氧化活性的影響[25]。

蘋果漿發(fā)酵對(duì)DPPH 和ABTS 自由基清除率的影響見圖6。

如圖6 所示，對(duì)比發(fā)酵前后蘋果漿對(duì)2 種自由基清除率的影響發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的蘋果漿對(duì)2 種自由基的清除率均有顯著提升（p＜0.01），其中發(fā)酵前蘋果漿對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基清除率為80.65%和75.57%，發(fā)酵后提高為94.72%和87.63%，表明其抗氧化活性增強(qiáng)。原因可能是在發(fā)酵過程中，植物乳桿菌對(duì)結(jié)合態(tài)多酚進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，釋放為游離態(tài)多酚，使發(fā)酵后蘋果漿的游離態(tài)多酚含量上升。同時(shí)，游離態(tài)多酚結(jié)構(gòu)上的酚羥基極易被氧化，且具有較強(qiáng)的捕獲自由基能力，不但可以有效抑制自由基產(chǎn)生，也可以有效清除人體內(nèi)過剩的活性自由基，發(fā)揮其抗氧化作用[26]。這與Mousavi Z E 等人[27]利用植物乳桿菌等乳酸菌混合發(fā)酵石榴果汁可以有效提高石榴果汁的DPPH 自由基清除能力及李虹甫等人[28]利用植物乳桿菌發(fā)酵藍(lán)莓果汁發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后藍(lán)莓果汁DPPH 自由基清除率顯著提高測(cè)定結(jié)果相似。由此可見，植物乳桿菌發(fā)酵果蔬不但可以增強(qiáng)了抗氧化活性，同時(shí)也可以有效改善自由基帶來的氧化損傷[29]。

3 結(jié)論

基于單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿的工藝優(yōu)化，探究蘋果漿發(fā)酵前后多酚含量的變化及其抗氧化能力。結(jié)果表明，影響發(fā)酵蘋果漿中植物乳桿菌活菌數(shù)的主要因素依次為發(fā)酵溫度、初始pH 值、初始糖度，最佳發(fā)酵條件為初始糖度14 °Bx，初始值pH 4.4，發(fā)酵溫度33.2 ℃；發(fā)酵后蘋果漿中游離態(tài)多酚含量上升，而結(jié)合態(tài)多酚含量下降；發(fā)酵后蘋果漿抗氧化能力也明顯提高。因此，采用植物乳桿菌發(fā)酵蘋果漿利于開發(fā)蘋果漿功能食品，后續(xù)可針對(duì)風(fēng)味物質(zhì)和感官指標(biāo)等進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高產(chǎn)品風(fēng)味與穩(wěn)定性。