譚安安，陳晨

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，CHD）與內(nèi)源性物質(zhì)的代謝異常密切相關(guān)，炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)亡引起的動脈粥樣硬化（AS）是導(dǎo)致冠心病發(fā)生、發(fā)展的重要原因[1,2]。PI3K/AKT通路不僅具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和行為的功能，也是重要的調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和反應(yīng)的通路，PI3K/AKT通路激活通過直接誘導(dǎo)其下游的血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)，消除活性氧（ROS）水平并抑制炎性細(xì)胞因子白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎性因子的表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)[3,4]。研究顯示提高CHD動物模型中的PI3K/AKT通路的水平可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞。長春西汀是一種磷酸二酯酶（PDE）抑制劑，不但可調(diào)控AS的發(fā)生，還可調(diào)節(jié)生物電信號放松平滑肌細(xì)胞增加血流量[5]。最新研究顯示長春西汀可緩解CHD并抑制炎性反應(yīng)[6]。但關(guān)于長春西汀緩解CHD的機(jī)制仍不明確。本文主要通過研究長春西汀對CHD大鼠模型氧化應(yīng)激反應(yīng)和PI3K/AKT的影響，探究分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用長春西汀治療CHD，提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 SD大鼠（SPF級，雄性220～250 g，上海斯萊克實驗動物中心，中國）。長春西?。℉20133334，遂成藥業(yè)，中國）。SMT100V小動物自動生化分析儀（南京電子醫(yī)療器械廠，中國）。Hoechst 33258溶液試劑（Merck 公司，德國）。CCK-8和ELISA試劑盒（碧云天公司，中國）。酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國）。組織勻漿機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。TRIzol（Sigma公司，美國）。PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒（Takara公司，日本）。RIPA裂解緩沖液（中國，北京，Beyotime）。BCA試劑盒（武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，中國）?？贵w購自美國Abcam公司。PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）。DMEM培養(yǎng)基和抗體、血清（Invitrogen公司，美國）。顯微鏡和倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 分組和建模 30只SD大鼠分為對照組、CHD組和CHD+長春西汀組（每組n=10），根據(jù)文獻(xiàn)構(gòu)建CHD模型[7]，自制高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)8周，高脂飼料在正常飼料中加入蛋黃粉（10%）、膽固醇（2%）、豬油（10%）、丙基硫氧嘧啶（0.2%）、膽酸鈉（0.5%），30 g/d。對照組的10只大鼠應(yīng)用正常飼料喂養(yǎng)，30 g/d。通過尾靜脈收集血樣，用SMT100V小動物自動生化分析儀檢測三酰甘油（TG）和膽固醇（TC）和高密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）驗證建模結(jié)果。CHD+長春西汀組大鼠腹腔注射長春西汀，劑量為1.0 mg/kg[8]，其余兩組大鼠注射等量的生理鹽水作為對照，連續(xù)7 d。

1.3 指標(biāo)和方法

1.3.1 ELISA 應(yīng)用ELISA檢測心肌酶指標(biāo)、炎性因子和內(nèi)皮功能指標(biāo)。大鼠麻醉后處死，采集心臟內(nèi)的血液樣本，離心（2000 rpm，20 min）后收集上層血清。根據(jù)試劑盒說明書分別加入抗體和顯色劑，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算乳酸脫氫酶（LD）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的濃度，炎性因子IL-6和TNF-α的濃度，以及內(nèi)皮功能指標(biāo)內(nèi)皮素-1（ET-1）和一氧化氮（NO）。

1.3.2 HE染色檢測心肌細(xì)胞損傷 大鼠腹腔注射戊巴比妥后斷頭處死，取出心臟，收集結(jié)扎周圍的心肌組織用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為4 μm的切片制作玻片標(biāo)本。加入Mayer's蘇木精在室溫下賦孵育10 min，加入0.5%曙紅溶液室溫下孵育3 min，顯微鏡下觀察。

1.3.3 氧化應(yīng)激指標(biāo) 將心肌組織制作成組織勻漿，以3000 rpm離心25 min，根據(jù)的速度氧化應(yīng)激試劑盒（三工生物技術(shù)有限公司，中國）檢測丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水品。

1.3.4 qPCR 使用Trizol獲得心肌組織中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1μg RNA用于合成cDNA（42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃保存）。使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行qPCR實驗（95℃/10 min，40個循環(huán)，94℃/15 s，60℃/1 min， 60℃/1 min，4℃保存）。使用GAPDH6作為內(nèi)參，比較循環(huán)閾值（ΔΔCt）用于分析PI3K和AKT mRNA的水平表達(dá)。

1.3.5 Western blot 將心肌組織用勻漿機(jī)均勻研磨萃取總蛋白，通過BCA試劑盒測量濃度。

分別取總量為40 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（PAGE）（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室溫孵育1 h。將1:500稀釋的anti-PI3K和anti-AKT添加到分離的蛋白質(zhì)中，4℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑顯影。GAPDH用作內(nèi)部參考。Image J軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05，為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長春西汀對CHD模型大鼠血脂的影響 CHD組大鼠的TC（3.25±0.35）mmol/L、TG（1.36±0.14）mmol/L、LDL（1.89±0.27）mmol/L均高于對照組（P＜0.05），CHD+長春西汀組的TC（2.64±0.31）mmol/L、TG（0.93±0.12）mmol/L、LDL（1.25±0.22）mmol/L水平高于對照組而低于CHD組（P＜0.05），表1。

表1 長春西汀對CHD模型大鼠血脂的影響

2.2 長春西汀對CHD大鼠模型心肌酶指標(biāo)的影響 CHD組大鼠的LD（2374.27±278.43 IU/L）與CK-MB（1264.44±142.53 IU/L）均高于對照組（P＜0.05），CHD+長春西汀組LD（1804.93±271.36IU/L）和CK-MB（865.28±131.69IU/L）高于對照組而低于CHD組（P＜0.05），表2。

表2 長春西汀對CHD大鼠模型心肌酶的影響

2.3 長春西汀對CHD大鼠模型炎性因子的影響 CHD組大鼠的IL-6（14.47±2.89）pg/ml和TNF-α（11.46±2.04）pg/ml均高于對照組（P＜0.05），CHD+長春西汀組的IL-6（9.80±2.45）pg/ml和TNF-α（7.52±2.01）pg/ml水平高于對照組而低于CHD組（P＜0.05），表3。

表3 長春西汀對CHD大鼠模型炎性因子的影響

2.4 長春西汀對CHD大鼠模型內(nèi)皮功能的影響CHD組大鼠的ET-1（1.92±0.18 pg/ml）高于0.18 pg/ml）高于對照組而NO（30.75±6.73）μmol/L低于對照組（P＜0.05）。CHD+長春西汀組的ET-1（1.59±0.16）pg/ml高于對照組低于CHD組，而NO（39.24±9.76）μmol/L低于對照組，而高于CHD組（P＜0.05），表4。

表4 長春西汀對CHD大鼠模型內(nèi)皮功能的影響

2.5 長春西汀對CHD大鼠心肌組織損傷的影響對照組大鼠的心肌細(xì)胞成纖維狀有序排列，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色均勻，細(xì)胞核飽滿；CHD組大鼠心肌細(xì)胞染色不均勻，排列紊亂；CHD+長春西汀組的心肌組織損傷情況較CHD組有所緩解，心肌細(xì)胞染色不均勻但排列有序。

2.6 長春西汀對CHD大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響CHD組大鼠的MDA（10.56±1.06）nmol/ml高于對照組，SOD（116.84±10.64）U/ml低于對照組（P＜0.05）。CHD+長春西汀組的MDA（5.93±0.55）nmol/ml顯著高于對照組而低于CHD組，而SOD（158.59±12.18）U/ml低于對照組而高于CHD組（P＜0.05）。

2.7 長春西汀對CHD大鼠PI3K和AKT mRNA的影響 PI3K和AKT mRNA水平（1.32±0.13，1.05±0.11）顯著低于對照組（P＜0.05），CHD+長春西汀組的PI3K和AKT mRNA水平（4.75±0.46，4.83±0.47）顯著高于對照組和CHD組（P＜0.05）。

2.8 長春西汀對CHD大鼠PI3K/AKT通路的影響PI3K和AKT蛋白水平（0.98±0.08，1.05±0.09）均顯著低于對照組（P＜0.05），CHD+長春西汀組的PI3K和AKT蛋白水平（3.42±0.32，3.36±0.31）高于對照組和CHD組（P＜0.05），圖1。

圖1 Western blot檢測長春西汀對CHD大鼠PI3K和AKT蛋白的影響

3 討論

心血管疾病是全球死亡的主要原因[9]。AS引起的CHD以及相關(guān)的疾病是心血管疾病的最主要因素，包括血管腔狹窄、閉塞、心肌缺血、缺氧、壞死，心肌細(xì)胞的凋亡等[10]。

長春西汀是從毛竹毛葉中分離的一種半合成生物堿衍生物，通過抑制Na+通道和清除羥自由基來緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞代謝[11-14]。AS不但是CHD的關(guān)鍵發(fā)病誘因，也是中風(fēng)等腦血管疾病的主要機(jī)制之一，國內(nèi)研究顯示長春西汀對腦供血不足合并CHD病情起到緩解作用[15]。本次研究結(jié)果顯示長春西汀可明顯降低血脂指標(biāo)，還可抑制炎性反應(yīng)，從而提高血管內(nèi)皮功能，保護(hù)心肌細(xì)胞。提示長春西汀可能通過清除ROS、抑制炎性反應(yīng)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，提高冠脈供血，緩解心肌細(xì)胞損傷，起到治療CHD的作用。

氧化應(yīng)激起因于ROS的產(chǎn)生與抗氧化劑機(jī)制清除之間的不平衡，機(jī)體具有抗氧化防御機(jī)制，該機(jī)制由抗氧化劑分子（如谷胱甘肽）和酶（如SOD等）組成，以應(yīng)對氧化應(yīng)激。在生物分子中，脂質(zhì)易受到氧化應(yīng)激,多不飽和脂肪酸和LDL等脂質(zhì)是主要目標(biāo)，AS也是引起ROS的病理基礎(chǔ)之一[16]。氧化應(yīng)激水平受到PI3K/AKT通路的調(diào)控，PI3K/AKT會通過調(diào)控NF-κB或Wnt等途徑提高SOD的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示長春西汀可在mRNA和蛋白的水平上顯著抑制CHD大鼠心肌組織中PI3K/AKT通路，并抑制MDA和促進(jìn)SOD的表達(dá)。研究顯示長春西汀通過抑制NF-κB通路和誘導(dǎo)Nrf2/ARE通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。在腦缺血/再灌注動物中，長春西汀對PI3K/AKT起到誘導(dǎo)作用，并抑制炎性反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)損傷[19]。提示在CHD大鼠模型中，長春西汀通過誘導(dǎo)PI3K/AKT的表達(dá)抑制機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，不僅能保護(hù)冠脈內(nèi)皮細(xì)胞功能提高心肌血供，還能抑制炎性反應(yīng)，緩解心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，長春西汀可能通過促進(jìn)PI3K/AKT通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)，從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能和緩解心肌組織損傷，對CHD大鼠模型起緩解作用。但關(guān)于長春西汀調(diào)控PI3K/AKT通路的分子機(jī)制需進(jìn)一步分析，療效仍需臨床研究驗證。