層積前GA處理對老山芹種胚發(fā)育及物質(zhì)代謝的影響

李富恒，吳晶晶，趙恒田，張曉雯，張宏發(fā)，尚愛娟，馬匯聰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；3.東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱 150030）

老山芹是東北林區(qū)主要山野菜種類之一，學名興安獨活（Heracleum dissectumLedeb），為傘形科獨活屬多年生宿根草本植物[1]。其食用器官為嫩莖葉，味鮮美，營養(yǎng)豐富，有降糖降壓、退熱解毒、祛風除濕、清潔血液等功效，具有較高食用與藥用價值，深受廣大消費者喜愛。

種子休眠原因主要有種皮障礙、后熟作用及存在發(fā)芽抑制物質(zhì)等。研究表明，老山芹種子采收時種胚尚未發(fā)育完全，處于心形胚-魚雷形胚時期，存在后熟現(xiàn)象，播種后需較長時間發(fā)芽，且發(fā)芽率低、出苗不整齊、缺乏完善育苗技術，限制老山芹產(chǎn)業(yè)發(fā)展。由于需求量不斷增加，過度采收造成野生資源日益枯竭，人工種植老山芹成為必然選擇。開展老山芹育苗技術研究，對改善林區(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構、發(fā)展林下經(jīng)濟、保護生態(tài)環(huán)境、實現(xiàn)老山芹規(guī)?；a(chǎn)具有重要理論及實踐意義。

赤霉素（Gibberellin，GA）是植物內(nèi)源激素之一，具有打破種子休眠，促進種子萌發(fā)作用。GA在促進種子萌發(fā)中可軟化種胚周圍組織，克服種皮機械限制；促進種胚生長[2]。研究表明，赤霉素與層積處理相結(jié)合有效打破野茉莉[3]、滇重樓[4]等種子休眠，促進種子萌發(fā)。老山芹研究主要集中于植株及種子生長發(fā)育特性[5]、層積條件下種子后熟過程[6]、變溫層積效果比較[7]、種子成熟度差異[8]、層積過程中種胚主要發(fā)育期間差異蛋白[9]等方面，缺乏GA處理對層積過程中種胚發(fā)育及物質(zhì)代謝影響的系統(tǒng)研究。

本研究以老山芹種子為研究對象，測定不同濃度GA處理后變溫層積過程中種胚形態(tài)及各種生理生化指標動態(tài)變化，分析比較各處理種子后熟進程，為深入研究老山芹種子休眠及萌發(fā)機制、提高種子處理效果和發(fā)芽率、保障種苗供應、發(fā)展老山芹產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為七年生老山芹植株收獲種子，購于黑龍江省大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學研究院。種子采收后自然陰干備用。

1.2 方法

1.2.1 GA浸種

取籽粒飽滿種子清水洗凈，分別于200、300、400 mg·L-1GA浸泡24 h，蒸餾水處理為對照。

1.2.2 變溫層積及取樣

將細砂洗凈后置于110℃烘箱中高溫滅菌3 h，冷卻后備用。將GA浸泡后種子與細砂以1∶2攪拌混勻，放入塑料盒（長×寬×高=19 cm×13 cm×11 cm）中，在塑料蓋頂部打孔，利于種子呼吸。采用20℃，10 d→4℃，90 d→20℃，5 d變溫層積方式。分別于 0、15、30、45、60、75、90、105 d取樣，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 種胚形態(tài)指標測定

取不同層積時期種子，去除種皮后游標卡尺測定胚乳長。解剖刀挑出種胚后制成臨時裝片，在顯微鏡下用直線式測微尺測定胚長。重復測定10次取平均值，計算胚率：

胚率（%）=胚長/胚乳長×100%。

胚乳長：去除種皮后用游標卡尺測量種子長度最大值。

胚長：直線測微尺測量種胚長度最大值。

1.2.4 種子生理生化指標測定

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G250法；可溶性糖和淀粉含量測定采用蒽酮法；粗脂肪含量測定采用索氏提取法[10]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.05統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA處理對老山芹種胚發(fā)育進程的影響

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，老山芹種子存在形態(tài)后熟現(xiàn)象，即采收后種胚尚未發(fā)育完全，且種子成熟度不一致，其中大部分種胚處于心形胚階段（見圖1A），小部分種胚處于魚雷形胚階段（見圖1B），在層積過程中種胚繼續(xù)發(fā)育，逐漸達到子葉期胚階段（見圖1C-D），完成形態(tài)后熟過程，具備發(fā)芽潛在能力。根據(jù)此生物學特征，在種子采收時應當分期采收，盡量減少種子成熟度差異，利于出苗整齊一致。

圖1 不同濃度赤霉素處理下老山芹種胚發(fā)育進程Fig.1 Development of embryo in Heracleum dissectum Ledeb seeds under different concentrations of gibberellin

層積開始前3個GA處理及對照老山芹種胚多處于心形胚時期。層積至15 d時，各處理種子從20℃暖溫轉(zhuǎn)入4℃低溫，種胚較未層積前體積變大，但形態(tài)上差別不明顯，大多數(shù)種胚仍處于心形胚時期。

隨層積時間延長，層積30 d時各處理種胚形態(tài)開始出現(xiàn)差異：處理一和對照種胚仍停留在心形胚時期，而處理二和三種胚已發(fā)育至魚雷胚時期。說明層積前GA處理促進層積過程中種胚發(fā)育，其中以較高濃度GA效果更佳。

層積至45 d時，對照與處理一種胚已發(fā)育至魚雷形胚階段；處理二和三種胚體積增加，發(fā)育至子葉期胚初期階段，可觀察到兩片子葉輪廓。

層積至60 d時，對照種胚仍滯留在魚雷形胚階段，而處理一由魚雷形胚發(fā)育至子葉期胚初期階段；處理二和三種胚兩片子葉繼續(xù)伸長。處理三種胚形態(tài)已定型，體積大于其他處理。

層積至75 d時，對照種胚已發(fā)育至子葉期胚初期階段，處理一處于子葉期胚階段，形態(tài)定型；處理二種胚體積大于處理一，但子葉脈序仍較模糊；處理三種胚體積大于其他各處理，子葉上已觀察到清晰脈序，部分種子開始萌發(fā)。

層積至90 d時，除對照種胚子葉上脈序還較模糊外，其他處理子葉上均觀察到清晰脈序。處理一和二有少量種子發(fā)芽，處理三種子發(fā)芽數(shù)量較多。說明此時處理一和二部分種胚已完成形態(tài)后熟，具備發(fā)芽能力；處理三種子已進入大量發(fā)芽時期。

層積至105 d時，對照種子開始少量萌發(fā)，處理一和二種子大量發(fā)芽。

由以上分析可看出，層積前GA處理加快老山芹種子后熟過程，種胚發(fā)育快，發(fā)芽早，其中以赤霉素濃度為400 mg·L-1處理（處理三）效果最佳。與對照相比，處理三完成種胚發(fā)育和具備發(fā)芽能力時間比對照提前30 d。

2.2 GA處理對層積過程中老山芹種胚形態(tài)指標的影響

2.2.1 胚長

由圖2可見，隨層積時間增加，對照及3個GA處理老山芹種胚不斷生長發(fā)育，種胚長度均有不用程度增加，GA濃度越高，種胚生長速度越快。

層積前對照及3個GA處理種胚長度分別為0.50、0.52、0.55、0.54 mm，各處理間無顯著差異。

層積至15 d時，對照及3個GA處理胚長分別增長至0.57、0.59、0.60和0.62 mm，與層積前相比分別增長14%、13.5%、9.1%和14.8%，其中處理三增長速率最快。各處理相比較，處理三極顯著高于對照，顯著高于處理一，與處理二無顯著差異；處理二顯著高于對照，而與處理一差異不顯著；處理一和對照無顯著差異。

層積至30 d時，對照及3個GA處理胚長分別為0.66、0.74、0.65和0.78 mm，與層積15 d相比分別增長15.8%、25.4%、8.3%和25.8%，處理三仍保持較快增長速率。各處理相比較，處理三極顯著高于對照和處理二，顯著高于處理一；處理一極顯著高于對照和處理二；處理二與對照間無顯著差異。

層積30 d后胚長增長速率加快，層積45 d時，對照及3個GA處理胚長分別為1.02、1.06、1.10和1.13 mm，與層積30 d相比分別增長54.5%、43.2%、69.2%和44.9%，其中處理二增長速率最快。說明層積30～45 d胚乳中貯藏營養(yǎng)物質(zhì)被大量分解為小分子有機物供應種胚，使種胚生長速率加快，胚長增長50%。各處理相比較，處理三顯著高于對照和其他處理；處理一、二和對照間差異不顯著。

圖2 不同濃度赤霉素處理下種胚長度變化Fig.2 Changes of embryos length under different concentrations of GA

層積60 d時，各處理胚長分別為1.28、1.30、1.35和1.41 mm，與層積45 d相比分別增長25.5%、22.6%、22.7%和22.1%，增長速率較上一取樣期下降。此時形態(tài)后熟過程完成，各處理種胚形態(tài)陸續(xù)進入子葉期胚階段。各處理相比較，處理三極顯著高于對照和其他處理；處理二極顯著高于對照和處理一；處理一顯著高于對照。

層積75 d時，與層積60 d相比各處理胚長分別增加0.94、1.07、1.08和1.09 mm，增長速率分別為73.4%、82.3%、80%和77.3%。各處理種胚增長迅速，其中處理二增長最快。這時種胚增長主要得益于子葉快速伸長。各處理相比較，處理三極顯著高于對照和其他處理；處理二極顯著高于處理一和對照；處理一極顯著高于對照。各處理間胚長均呈極顯著差異。

層積90 d時，各處理胚長分別為2.98、3.10、3.14和3.22 mm，與層積75 d相比分別增長34.2%、30.8%、29.2%和28.8%。增長速率變慢，其中對照增長速率最快，因其種胚發(fā)育相對滯后，完成形態(tài)后熟時間較晚。各處理相比較，處理三極顯著高于對照和其他處理；處理二極顯著高于處理一和對照；處理一極顯著高于對照。與上一個取樣期相同，各處理間胚長均表現(xiàn)為極顯著差異。

層積105 d時，各處理胚長分別為3.14、3.20、3.33和3.42 mm，與層積90 d相比分別增長5.4%、3.2%、6.1%和6.2%。此時層積結(jié)束，種子已具有萌發(fā)能力，部分種子已發(fā)芽，故增長速率大幅變小。

層積結(jié)束與層積前相比各處理種胚長度分別增加2.64、2.68、2.78和2.88 mm，為層積前胚長5倍。層積過程中各處理種胚生長均呈慢-快-慢趨勢，符合生長大周期規(guī)律，其中處理三（GA濃度為400 mg·L-1）種胚發(fā)育最快。

2.2.2 胚率

胚率反映種胚發(fā)育程度，胚率越大說明種胚發(fā)育程度越高。如圖3所示，種子層積前種胚較小，對照及3個GA處理胚率分別為10.95%、11.26%、11.51%和11.31%，各處理間無顯著差異。

層積至15 d時，對照和3個GA處理胚率分別為11.98%、12.75%、12.11%和13.06%，以百分數(shù)計算，較層積前增長率分別達9.4%、13.2%、5.2%和15.5%。差異顯著性分析結(jié)果表明，處理三極顯著高于對照和處理二，與處理一差異不顯著；處理一極顯著高于對照，顯著高于處理二；處理二和對照差異不顯著。

層積30 d時，對照和3個GA處理胚率分別為13.75%、15.66%、13.41%和16.18%，以百分數(shù)計算，較層積15 d時增長率分別達14.8%、22.8%、10.7%和23.9%，其中處理三胚率增長百分率最大。各處理相比較，處理三極顯著高于其他處理和對照；處理一極顯著高于對照和處理二；對照和處理二差異不顯著。

層積45 d時，對照和3個GA處理胚率分別為21.47%、22.80%、23.31%和23.40%，以百分數(shù)計算，較層積30 d時增長率分別達56.1%、45.6%、73.8%和44.6%，增長速率加快，其中處理二增長速率最快。各處理相比較，處理三和處理二極顯著高于對照和處理一；處理一極顯著高于對照；處理三與處理二差異不顯著。

層積60 d時，對照及3個GA處理胚率分別為26.98%、27.25%、29.09%和30.32%。以百分數(shù)計算，較層積45 d時增長率分別達25.7%、19.5%、24.8%和29.6%，增長速率減慢，其中處理三增長速率最快，已進入子葉期胚階段。各處理相比較，處理三極顯著高于處理二、處理一和對照；處理二極顯著高于處理一和對照；處理一顯著高于對照。

層積75 d時，對照及3個GA處理胚率分別為36.99%、40.00%、40.84%和43.39%，以百分數(shù)計算，較層積60 d時增長率分別達37.1%、46.8%、40.4%和43.1%，是層積過程中胚率增長較快時期之一，其中處理一增長速率最快。各處理相比較，處理三極顯著高于其他處理和對照；處理二和處理一極顯著高于對照；處理二和處理一差異不顯著。

層積90 d時，對照及3個GA處理胚率較上一取樣時期分別增長4.61%、4.51%、4.97%和4.03%，以百分數(shù)計算，增長率為12.5%、11.3%、12.2%和9.3%，增長速率下降。其中處理三胚率增長速率最小，已完成形態(tài)后熟。各處理相比較，處理三極顯著高于處理一和對照，顯著高于處理二；處理二極顯著高于對照，顯著高于處理一；處理一極顯著高于對照。

層積105 d時，對照及3個GA處理胚率分別為43.73%、45.36%、46.39%和47.85%，以百分數(shù)計算，較層積90 d時增長率分別達到5.1%、1.9%、1.3%和0.9%。此時，經(jīng)GA處理后種胚發(fā)育完全，胚率增長速率緩慢，不再增加，而對照種胚持續(xù)增長，較其余處理胚率增長速率快。各處理相比較，處理三極顯著高于其他處理；處理二極顯著高于對照和處理一；處理一極顯著高于對照。

層積結(jié)束后，各處理胚率均增加，赤霉素處理后胚率大于對照，其中處理三（GA濃度為400 mg·L-1）胚率最大，達47.85%。

2.3 層積過程中種子內(nèi)主要營養(yǎng)物質(zhì)動態(tài)變化

2.3.1 可溶性糖

不同濃度GA處理后老山芹種子可溶性糖含量動態(tài)變化如表1所示，層積過程中各處理可溶性糖含量變化趨勢不同。

層積前老山芹種胚處于休眠狀態(tài)，營養(yǎng)物質(zhì)多處于大分子貯藏階段，故可溶性糖含量低。經(jīng)水和不同濃度GA浸泡24 h后對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為184.67、223.56、223.50和235.68 mg·g-1，GA處理使分解酶活性提高，分解大分子有機物為小分子物質(zhì)，故GA處理后可溶性糖含量較對照升高。各處理相比較，處理三極顯著高于其他GA處理和對照；處理一和二與對照相比也表現(xiàn)出極顯著差異，而處理一和二差異不顯著。

層積至15 d時，由于種皮變軟，種子吸水能力增強，導致代謝活動增強，貯藏物質(zhì)分解加快。對照及3個GA處理可溶性糖含量快速增加。對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為289.00、303.11、311.43和324.33 mg·g-1，與層積前相比分別增加56.5%、35.6%、39.3%和37.6%，此時處理三可溶性糖含量達到其層積過程峰值。對照可溶性糖含量增速最高，可能與其種胚發(fā)育較慢、消耗營養(yǎng)物質(zhì)較少有關。各處理相比較，處理三極顯著高于對照和其他GA處理；處理二極顯著高于對照和處理一；處理一和對照相比也呈極顯著差異。

層積至30 d時，可溶性糖被大量消耗用于種胚生長發(fā)育，各處理可溶性糖含量均顯著下降。對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為242.83、239.00、234.83和174.30 mg·g-1，其中處理三可溶性糖含量下降46%。各處理相比較，對照極顯著高于3個GA處理；處理一極顯著高于其他GA處理；處理二與三呈極顯著差異。

層積至45 d時，對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為270.54、259.83、221.50和145.33 mg·g-1，其中處理二和三可溶性糖含量分別下降5.7%和16.6%；對照及處理一含量升高，分別增加11.4%和8.7%。這種變化趨勢與此期間處理二和三種胚發(fā)育較快有關。各處理相比較，對照可溶性糖含量極顯著高于3個GA處理；處理一極顯著高于處理二和處理三；處理二與處理三之間也呈極顯著差異。

圖3 不同濃度赤霉素處理下種胚胚率變化Fig.3 Changes of embyo rate under different concentrations of GA

層積至60 d時，對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為 290.50、352.86、289.17和90.50 mg·g-1，除處理三外，其他處理可溶性糖含量均回升。對照、處理一和二可溶性糖含量分別增加7.4%、35.8%、30.6%，而處理三減少37.7%，降低至層積過程最低點?？赡艽藭r處理三種胚發(fā)育較快，子葉面積增加消耗大量可溶性糖。各處理相比較，處理一極顯著高于其他處理；對照極顯著高于處理二和三；處理二極顯著高于處理三。

層積至75 d時，對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為306.67、307.33、323.83和248.67 mg·g-1，與層積60 d時相比處理一降低12.9%，而對照、處理二和三分別增加5.6%、12.1%、174.8%。處理三可溶性糖含量大幅上升，可能與其種胚形態(tài)后熟完成、可溶性糖消耗減少有關。各處理相比較，處理二極顯著高于其他各處理；處理一極顯著高于處理三，而與對照無顯著差異；處理三極顯著低于對照。

層積至90 d時，對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為315.61、235.00、329.33和204.17 mg·g-1，與層積75 d時相比處理一和三分別減少23.5%和17.9%；對照和處理二分別增加2.9%和1.7%，處理二達到層積過程最大值。各處理相比較，處理二極顯著高于其他處理；對照極顯著高于處理一和三；處理一極顯著高于處理三。

層積至105 d時，對照及3個GA處理可溶性糖含量分別為343.58、288.50、311.17和318.67 mg·g-1，與層積90 d時相比較，對照、處理一和三分別增加8.9%、22.8%和56.1%，而處理二減少5.5%。各處理相比較，對照極顯著高于其他各處理；處理三極顯著高于處理一和二；處理二極顯著高于處理一。

可溶性糖含量與多種物質(zhì)代謝及種子生命活動有關，層積過程中各處理可溶性糖含量變化趨勢不同，對照層積過程中可溶性糖含量除層積30 d外，其余取樣點均呈上升趨勢，且在105 d達到峰值；而經(jīng)GA處理種子可溶性糖含量起伏變化較大，其中處理三（GA濃度400 mg·L-1）變化幅度較大。

2.3.2 淀粉

各處理老山芹種子淀粉含量動態(tài)變化見表2。隨層積時間增加，各處理淀粉含量均呈下降趨勢，但下降速率不同。

層積前各處理淀粉含量分別為23.63、22.14、22.08和21.98 mg·g-1，GA浸泡后提高淀粉酶活性，加速淀粉分解，因此GA處理后淀粉含量低于對照。各處理相比較，對照極顯著高于3個GA處理；各GA處理之間差異不顯著。

層積至15 d時，淀粉被分解為可溶性糖等小分子物質(zhì)供種胚發(fā)育生長，含量迅速減少。對照和3個GA處理淀粉含量分別為20.19、19.35、19.22和18.28 mg·g-1，與層積前相比淀粉含量分別減少3.44、2.79、2.86和3.7 mg·g-1，減少幅度分別為14.6%、12.6%、13%和16.8%，其中處理三減少幅度最大。各處理相比，對照極顯著高于GA處理；處理一和二極顯著高于處理三；處理一和二之間無顯著差異。

表1 層積過程中可溶性糖含量變化Table 1 Changes of soluble sugar contents during stratification processes (mg·g-1)

表2 層積過程中淀粉含量變化Table 2 Changes of starch contents during stratification processes (mg·g-1)

層積至30 d時，對照和3個GA處理淀粉含量分別為18.54、17.12、17.05和15.21 mg·g-1，與層積15 d相比分別減少1.82、2.23、2.17和3.07 mg·g-1，減少幅度分別為9.0%、11.5%、11.3%和16.8%，處理三仍保持較大減少幅度。各處理相比較，對照極顯著高于其他處理；處理一和二極顯著高于處理三；處理一和二之間無顯著差異。

層積至45 d時，對照和3個GA處理淀粉含量分別為16.75、15.72、15.54和13.32 mg·g-1，與層積30 d相比減少幅度分別為9.7%、8.2%、8.9%和12.4%。各處理相比較，對照極顯著高于其他處理；處理一和二極顯著高于處理三；處理一和二之間無顯著差異。

層積至60 d時，與層積45 d相比較，對照及3個GA處理淀粉含量分別減少3.59、4.44、3.76和3.21 mg·g-1，減少幅度分別為21.4%、28.2%、24.2%和24.1%。在此期間各處理淀粉含量減少幅度增加，可能與此時各處理種胚發(fā)育加快、淀粉被淀粉酶加速分解利用有關。各處理相比較，對照極顯著高于其他處理；處理二極顯著高于處理三，顯著高于處理一；處理一極顯著高于處理三。

層積至75 d時，對照和3個GA處理淀粉含量分別為10.69、10.16、9.51和6.77 mg·g-1，較上一取樣點分別減少18.8%、9.9%、19.3%和33.0%。此階段處理三可溶性糖含量迅速積累，為淀粉含量下降速率最快時期，種胚發(fā)育已進入子葉期胚階段，子葉快速伸長需消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)。各處理相比較，對照極顯著高于處理二和三，顯著高于處理一；處理一極顯著高于處理二和三；處理二和三之間也呈極顯著差異。

層積至90 d時，對照及3個GA處理淀粉含量分別減少3.56、2.62、2.80和1.63 mg·g-1，減少幅度達33.3%、25.8%、29.4%和24.1%，其中，對照減少幅度最大。對照種胚發(fā)育相對滯后，此時子葉期胚階段，營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，淀粉大量被分解利用。各處理相比較，處理一極顯著高于對照、處理二和三；處理二極顯著高于對照和處理三；處理三極顯著低于處理二。

層積至105 d時，對照及3個GA處理淀粉含量分別為5.87、5.79、5.58和4.57 mg·g-1，減少幅度分別為17.7%、23.2%、16.8%和3.7%，此時處理三大量種子發(fā)芽，淀粉含量變化最小。各處理相比較，對照極顯著高于處理二和三，與處理一差異顯著；GA處理之間也呈極顯著差異；處理三極顯著低于處理二。

2.3.3 可溶性蛋白

層積過程中對照及3個GA處理種子中可溶性蛋白含量動態(tài)變化見表3。層積過程中可溶性蛋白質(zhì)含量變化波動較大，其中處理一、二與對照變化趨勢一致，而處理三在層積后期變化趨勢明顯區(qū)別于其他處理。

層積前各處理可溶性蛋白含量分別為718.60、719.45、723.93 和 727.89 mg·g-1。其中對照可溶性蛋白含量最低，GA處理可增加可溶性蛋白含量，且GA濃度越高，可溶性蛋白含量越多。各處理相比較，處理三極顯著高于其他處理；處理二極顯著高于對照和處理一；處理一與對照差異不顯著。

表3 層積過程中可溶性蛋白含量變化Table 3 Changes of soluble protein contents during stratification processes (mg·g-1)

層積15 d后，各處理可溶性蛋白含量較層積前分別增加193.91、234.12、282.75和334.75 mg·g-1，增長速率分別為27.1%、32.5%、39.1%和46.1%。層積過程中種子吸水吸膨后代謝活動逐漸活躍，可溶性蛋白含量迅速增加。其中處理三可溶性蛋白含量最高，增長速率最快，說明400 mg·g-1GA處理加速蛋白質(zhì)合成。各處理相比較，處理三極顯著高于對照及其他GA處理；處理二極顯著高于處理一；處理一與對照之間也表現(xiàn)極顯著差異。

層積至30 d時，各處理可溶性蛋白含量快速下降，對照及3個GA處理可溶性蛋白含量分別減少至747.06、693.80、769.51 和621.20 mg·g-1，下降速率達18.1%、27.2%、23.6%和41.5%，其中處理三下降速率最快，此時胚形態(tài)發(fā)生變化，可溶性蛋白被迅速分解為小分子物質(zhì)，為種胚生長提供能量。各處理相比較，處理二極顯著高于其他處理，對照極顯著高于處理一和三；處理一極顯著高于處理三。

層積至45 d時，各處理與上一取樣點比較，對照和處理一可溶性蛋白含量小幅回升，分別增加64.35、49.56 mg·g-1，增長速率分別達8.6%、7.1%，處理二及三分別增加183.4、335.45 mg·g-1，增長速率分別達23.8%、54.0%，漲幅明顯，且處理三達到層積過程中第二個峰值。處理二、三較對照和處理一種胚發(fā)育迅速，種子內(nèi)部代謝活動旺盛，因此可溶性蛋白變化幅度較大。各處理相比較，處理三和二極顯著高于對照和處理一；對照和處理一之間也呈極顯著差異；處理三顯著高于處理二。

層積至60 d時，各處理種胚持續(xù)生長發(fā)育，可溶性蛋白含量分別降至641.33、537.72、693.08和650.29 mg·g-1，較上一取樣點減少170.08、205.64、259.83和306.36 mg·g-1，各處理下降速率分別為21.1%、27.7%、27.3%和32.0%，此時處理三可溶性蛋白消耗最多，種胚發(fā)育最快；對照消耗最少，代謝活動較弱，發(fā)育遲緩。各處理相比較，處理三極顯著高于其他處理；處理三和對照均與處理一呈極顯著差異；而對照和處理三之間差異不顯著。

層積至75 d時，處理三可溶性蛋白含量持續(xù)下降，減少167.14 mg·g-1，下降速率為25.7%，此時處理三蛋白質(zhì)消耗大于合成，可溶性蛋白被分解轉(zhuǎn)化為糖等小分子物質(zhì)被種胚生長利用。而對照、處理一和二可溶性蛋白含量上升，分別增加11.6%、35.8%和8.6%。此時各種酶活性增加，而大多數(shù)酶本質(zhì)為蛋白質(zhì)，因此可溶性蛋白含量上升。各處理相比較，處理二極顯著高于對照和處理三；處理一極顯著高于處理三；處理一和二之間無顯著差異；對照和處理一之間也無顯著差異。

層積至90 d時，對照及3個GA處理可溶性蛋白含量均下降，較上一取樣點分別減少190.07、136.17、179.14 和 90.27 mg·g-1，下降速率分別為26.5%、18.7%、23.8%和18.7%，此時對照消耗可溶性蛋白最多，胚發(fā)育最晚。各處理比較，處理一和二極顯著高于對照和處理三；對照極顯著高于處理三；處理一顯著高于處理二。

層積至105d時，對照及3個GA處理可溶性蛋白含量分別減少139.04、128.22、90.40和50.93 mg·g-1，下降速率分別達26.4%、21.6%、15.8%和13.0%，此時對照下降最多，處理三下降最少，由于對照種子在105 d時萌發(fā)種子較少，休眠未完全解除，因此仍需消耗較多可溶性蛋白為種子萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)。各處理比較，處理一和二極顯著高于對照和處理三；對照和處理三之間呈顯著差異；處理一和二之間無顯著差異。

層積過程中可溶性蛋白質(zhì)變化較為復雜，與未層積前相比各處理均減少，其中處理三在層積過程中出現(xiàn)兩個峰值且均極顯著高于對照，在層積60 d后持續(xù)下降，可溶性蛋白被不斷消耗供種胚發(fā)育，種胚發(fā)育最快。

2.3.4 粗脂肪

各處理老山芹種子粗脂肪含量動態(tài)變化如表4所示。層積前粗脂肪含量8%。層積過程中脂肪逐漸被降解，總體呈下降趨勢。層積前期下降較快，后期下降較慢。

層積前對照和3個GA處理種子粗脂肪含量分別為8.67%、8.78%、8.96%和8.82%。各處理相比較，處理二顯著高于對照；對照、處理一和三之間差異不顯著。

層積15 d后，種子內(nèi)粗脂肪含量下降，但幅度較小。與層積前相比分別減少0.42%、0.64%、0.68%和0.37%，下降速率達4.8%、7.3%、7.6%和4.2%，其中處理二下降速率最大。各處理相比較，處理三極顯著高于處理一，顯著高于對照和處理二；處理一、二和對照之間均無顯著差異。

層積至30 d時，對照和3個GA處理粗脂肪含量分別下降至7.73%、7.54%、7.25%和7.14%，與層積15 d相比下降速率分別為6.3%、7.4%、12.4%和15.5%。此階段粗脂肪含量下降速率明顯高于層積15 d，其中處理二和三粗脂肪含量下降速率高于對照和處理一。說明層積前較高濃度GA處理有利于層積過程中脂肪分解代謝。各處理相比較，對照極顯著高于處理二和三，顯著高于處理一；處理一極顯著高于處理二和三；處理二和三之間差異不顯著。

表4 層積過程中粗脂肪含量變化Table 4 Changes of crude fat contents during stratification processes (mg·g-1)

層積至45 d時，與層積30 d時相比粗脂肪含量分別減少0.36%、0.59%、0.53%和0.88%，與層積30 d相比下降速率分別為4.7%、7.8%、7.3%和12.3%。其中處理三仍保持較高下降速率，而其他處理下降速率變慢。各處理相比較，對照極顯著高于處理二和三，顯著高于處理一；處理一極顯著高于處理三，與處理二差異不顯著；處理三顯著低于處理二。

層積至60 d時，對照及3個GA處理粗脂肪含量分別為6.74%、6.35%、6.13%和5.75%，與層積45 d相比下降速率分別為8.5%、8.6%、8.8%、8.1%，對照、處理一和二下降速率提高，其中對照提高3.8%，與此時對照種胚發(fā)育加快，需消耗較多營養(yǎng)物質(zhì)有關。隨GA濃度增加，粗脂肪含量逐漸減少，其中處理三含量最低。各處理間比較，對照極顯著高于3個GA處理；處理一極顯著高于處理三，顯著高于處理二；處理二極顯著高于處理三。

層積至75 d時，對照及3個GA處理粗脂肪含量較上一取樣時期減少0.49%、0.51%、0.44%和0.57%，與層積60 d相比下降速率分別為7.3%、8.0%、7.2%和9.9%，除處理三外，其他處理下降速率均有不同程度減少，此時處理三種胚已發(fā)育完全。各處理相比較，對照極顯著高于3個GA處理；處理一和二極顯著高于處理三；處理一和二無顯著差異。

層積至90 d時，對照及3個GA處理粗脂肪含量下降至5.65%、5.35%、4.84%和4.54%，與層積75 d相比下降速率分別為9.6%、8.4%、14.9%和14.4%，各處理下降速率均提高，其中處理二下降速率最快。各處理相比較，對照極顯著高于其他處理；處理一極顯著高于處理二和三；處理三極顯著低于處理二。

層積至105 d時，對照和3個GA處理粗脂肪含量分別下降1.14%、1.01%、0.61%和0.43%，與層積90 d相比下降速率分別為20.2%、18.9%、12.6%和9.5%，其中對照和處理一分解速率加快，處理二和三分解速率減慢。各處理相比較，對照極顯著高于其他處理；處理一極顯著高于處理三，顯著高于處理二；處理二與三差異顯著。

在層積過程中粗脂肪含量不斷下降，脂肪被分解利用，種胚逐漸完成后熟過程。GA處理促進作用以處理三（GA濃度為400 mg·L-1）效果最佳。

3 討論

3.1 GA處理對種子層積效果的影響

具有活力的種子在條件適宜情況下仍無法萌發(fā)的現(xiàn)象稱為種子休眠。種子休眠特性一方面利于種質(zhì)資源保護，但也制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。層積以及GA處理是解除種子休眠常用方法。層積時將種子和基質(zhì)（河沙、蛭石、珍珠巖等）在低溫、高溫和變溫條件下混合放置。層積處理對種皮透性（透氣、透水）、種胚發(fā)育、激素比、內(nèi)源抑制物、相關酶活及基因啟動均有影響[11]。研究表明，低溫層積可有效消除紫椴種子發(fā)芽抑制物質(zhì)的抑制作用，保持種子活力[12]。

外源GA影響種子內(nèi)源激素含量，提高分解大分子物質(zhì)酶（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等）活性，促進物質(zhì)代謝，加快種子后熟及萌發(fā)過程。500 mg·L-1GA處理提高節(jié)節(jié)麥發(fā)芽率[13]；東北軟棗獼猴桃等植物種子中也驗證GA有利于解除種子休眠[14]。

對于休眠原因較為復雜種子，單一方法解除休眠效果差，需多種方法并用。研究結(jié)果表明，使用200 mg·L-1GA處理后再變溫層積可有效打破圓齒野鴉椿種子休眠[15]；層積前經(jīng)高濃度GA處理縮短頑拗性三七種子后熟時間[16]。本研究結(jié)果表明，層積前400 mg·L-1GA溶液浸種24 h后再變溫層積，使老山芹種胚提前30 d完成形態(tài)后熟過程，縮短層積時間，使種子盡早具備萌發(fā)能力。但本研究選用GA濃度過少，今后應增加對400 mg·L-1以上濃度處理層積效果研究，確定最佳GA處理濃度。

3.2 GA處理對層積過程中種子物質(zhì)代謝的影響

在層積過程中，種子需充足物質(zhì)和能量供應以維持其呼吸和其他代謝活動，營養(yǎng)物質(zhì)源于種胚中貯藏物質(zhì)，主要包括糖類、蛋白質(zhì)和脂肪等。種子后熟是一個將大分子物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)供種胚生長發(fā)育，直至解除休眠過程，這一過程中貯藏物質(zhì)經(jīng)歷復雜的代謝變化。

可溶性糖作為呼吸作用底物，其含量反映種子內(nèi)部糖類物質(zhì)運轉(zhuǎn)情況，也反映呼吸作用和代謝強弱，可作為種子休眠狀態(tài)代謝標記[17]。不同濃度GA處理西洋杜鵑花瓣，隨GA濃度增加，可溶性糖含量升高[18]。黃珍等研究表明，經(jīng)GA3處理后，華重樓種子在0～15 d階段可溶性糖呈下降趨勢[19]。本研究結(jié)果表明，層積前期可溶性糖含量呈上升趨勢，層積15 d后持續(xù)下降。因GA處理后增加淀粉酶活性，淀粉分解成可溶性糖，用于種胚生長發(fā)育。隨種胚發(fā)育，可溶性糖被大量消耗，其含量開始下降。采用低濃度GA處理紫椴種子，可溶性糖含量也表現(xiàn)為前期快速升高趨勢[20]。

淀粉是種子中主要貯藏物質(zhì)，種子解除休眠過程中處于分解與合成動態(tài)平衡，一般前期合成占優(yōu)勢，后期以分解為主。劉月洋等研究表明，GA3處理誘導天女木蘭種子內(nèi)部淀粉含量下降[21]。

脂肪也是種子中主要貯藏物質(zhì)之一，其貯存能力遠高于糖類，可為種胚發(fā)育提供營養(yǎng)和能量。老山芹種子在解除休眠過程中，淀粉和脂肪保持下降趨勢，層積后期下降趨勢變緩。GA顯著促進棉花種子脂肪降解[22]。

蛋白質(zhì)含量是反映植物體內(nèi)物質(zhì)代謝重要生理指標，在種子解除休眠過程中，一部分蛋白被降解為游離氨基酸，用于蛋白質(zhì)重組，另一部分經(jīng)脫氨轉(zhuǎn)化為各種糖類供種胚生長利用[23]。胥雪峰研究表明，GA3處理使黃芪可溶性蛋白含量呈先降后升趨勢[24]。本研究中老山芹種子內(nèi)可溶性蛋白含量變化趨勢較為復雜，層積前期可溶性蛋白大量積累，之后下降，又呈上升趨勢。由于GA增強淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等相關酶活性，提高種胚內(nèi)部新陳代謝，貯藏物質(zhì)之間相互轉(zhuǎn)化，因此可溶性蛋白含量變化較大。

4 結(jié) 論

a.老山芹種子存在胚形態(tài)后熟現(xiàn)象，采收時多處于心形胚時期，在層積過程中種胚逐漸發(fā)育，完成形態(tài)后熟。

b.在層積過程中各處理淀粉和粗脂肪含量呈下降趨勢；可溶性糖含量表現(xiàn)為先升后降趨勢；可溶性蛋白含量變化較大，表現(xiàn)為先升后降再升再降趨勢。

c.層積前經(jīng)GA浸種24 h使種胚提前完成形態(tài)后熟，其中處理三（400 mg·L-1）效果最佳，與對照相比使種胚提前30 d完成形態(tài)后熟。