楊 波，衛(wèi) 穎，梁長梅，張鵬飛，牛鐵泉，樊瑋鑫，溫鵬飛

（1.山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學信息科學與工程學院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學實驗教學示范中心，山西太谷030801）

葡萄葉片是一種來源于自然，安全無害的傳統(tǒng)中藥材，具有安胎、消腫、利尿作用，并且含有豐富的維生素和礦物質[1]，具有很高的營養(yǎng)價值，可用于新鮮食品（如土耳其、希臘等的菜肴[2]）的制備，也可從中提取藥物添加劑[3]，因其蛋白含量豐富，亦可作為飼料添加劑，改善禽魚肉蛋等產(chǎn)品質量、降低飼料消耗率。葡萄葉片中含有大量多酚類化合物，如黃酮醇、黃酮[4]、酚酸和黃烷-3-醇[5]（如兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素等）以及少量二苯乙烯（如白藜蘆醇、反式白藜蘆醇等）類物質[6]，具有潛在開發(fā)和利用價值。其中，黃烷-3-醇不僅參與植物本身的生長發(fā)育[7]，賦于植物抗紫外線、抗蟲害、抗傷害、抗離子毒害等功能[8]，對人類健康也具有重要作用，由于其具有極強的抗氧化功能[9]，在抗菌、抗病毒、抗癌、抗血栓、抗腫瘤、降血壓、降低心臟代謝風險[10]等方面具有重要作用。葡萄日常管理中，為了保證果實的質量，會多次除去植株外周葉片，作為廢棄物丟棄。此外，葡萄植株每年自然脫落的葉片，多被焚燒，不但造成天然酚類物質資源的浪費，還污染環(huán)境，造成了一定的資源損耗和經(jīng)濟浪費。因而，對廢棄葡萄葉片的酚類物質富集研究可以有效利用生態(tài)資源。

葡萄葉片中多酚類物質的合成和積累不僅受到結構基因、調節(jié)基因的調控，還受到外界條件（如光照、水分、外源激素）的影響。其中，水楊酸（Salicylic acid，SA）作為一種植物調節(jié)劑[11]，不僅能夠促進植物（如大麥[12]、當歸[13]）幼苗生長，而且能夠促進植物細胞分裂、伸長和次生代謝物積累，誘導一系列與抗逆有關的基因表達，提高植物的抗鹽性[14]、耐熱性[15]和抗寒性。KUMARI等[16]研究證實，水楊酸和殼聚糖的聯(lián)合處理，保持了荔枝果實中較高的花青素、總酚、類黃酮含量[17]。GHASEMZADEH等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外源SA可以誘導生姜花色苷的合成。GIMéNEZ等[19]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L SA可顯著提高采收期甜櫻桃果實總酚酸含量。許玉超[20]研究表明，外源SA可顯著增加白菜葉片的總酚含量。IDREES等[21]、KHAN等[22]觀察到葉面噴施0.5 mmol/L SA可顯著提高水稻幼苗、紫花苜蓿幼苗的花青素含量。因而，外源SA對植物多酚物質，特別是總酚、花青素具有一定調控作用，但是對黃烷醇類多酚，特別是對黃烷-3-醇的積累研究鮮見報道。

本研究采用外源水楊酸（SA）孵育葡萄新梢的方法，初步探究了SA對葡萄葉片黃烷-3-醇積累的作用，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試早黑寶葡萄采自山西農(nóng)業(yè)大學園藝站溫室，株行距2.5 m×1.0 m，籬架栽植，常規(guī)管理。

1.2 試劑

兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯標準品、福林酚均購自索萊寶公司；乙腈、冰乙酸、無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇等試劑均購自國內國藥公司。

1.3 試驗方法

選取30株健康且長勢基本一致的早黑寶葡萄，采集新梢（帶葉柄7～10 cm），將葉柄插入錐形瓶中，以0.5 mmol/L SA孵育為處理，以蒸餾水孵育為對照（SA及蒸餾水液面高度保持在錐形瓶高度的4/5處），每個錐形瓶中插8個，5個錐形瓶為一組，9：00放于ED型光照培養(yǎng)箱（光照強度2 000 lx、相對濕度70%、溫度25℃）中培養(yǎng)，分別于0、1、3、6、12、24、72、120、192、240 h取葉片于液氮中凍存待用。每個處理設置3次重復。

1.4 測定項目及方法

總酚、總類黃酮測定參照陳建業(yè)[23]方法，稍作修改?？傸S烷-3-醇測定參照楊麗等[24]方法，稍作修改。黃烷-3-醇單體測定利用高效液相色譜法。

1.4.1 標準溶液的制備 分別精確稱取黃烷-3-醇中的標準品兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯，用甲醇配制成1 mg/mL的標準母液，再稀釋成不同濃度的工作液，-20℃保存。

1.4.2 色譜條件Themo Fisher UltiMate3000色譜儀，Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，280μm），Dionex Ultimate 300 Diode Array Detector檢測器，流動相B為1.3%冰乙酸，流速1.0 mL/min；檢測波長為280 nm，柱溫為30℃，進樣量為5μL。

1.4.3 樣品前處理 參照溫鵬飛[8]方法，略有修改。葡萄葉片于液氮下迅速研磨至粉末狀，準確稱取0.3 g于10 mL離心管中，加入3 mL 70%甲醇，上下?lián)u勻10次，超聲波提取15 min；10 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL，12 000 r/min離心10 min，取上清液，過夜浸提，經(jīng)0.45μm有機微孔濾膜過濾，恒溫旋轉蒸發(fā)8 min后加入1 mL純凈水提取，加入2 mL乙酸乙酯，搖勻靜置后取上層液體，恒溫旋轉蒸發(fā)5 min后用1 mL純甲醇提取，經(jīng)0.22μm有機微孔濾膜過濾后，高效液相色譜儀測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用SAS 8.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 SA孵育對早黑寶葡萄葉片總酚含量的影響

在0～6 h內，相比對照，總酚含量隨SA孵育時間的加長而增加，在1 h時出現(xiàn)最高峰，總酚含量在1、3 h時極顯著高于對照，192 h時顯著低于對照，240 h時極顯著低于對照，其他孵育時間與對照間無顯著性差異（圖1）。

2.2 SA孵育對早黑寶葡萄葉片總類黃酮含量的影響

在0～6 h內，相比對照，總類黃酮含量隨SA孵育時間的加長而增加，總類黃酮含量在1 h時出現(xiàn)最高峰，總類黃酮含量在1、3 h時顯著高于對照，12、72、240 h時顯著低于對照，192 h時極顯著低于對照，其他孵育時間與對照間無顯著性差異（圖2）。

2.3 SA孵育對早黑寶葡萄葉片總黃烷-3-醇含量的影響

在0～3 h內，相比對照，總黃烷-3-醇含量在SA孵育3 h時出現(xiàn)高峰?？傸S烷-3-醇含量在1、3 h時極顯著高于對照，72、240 h時顯著低于對照，192 h時極顯著低于對照，其他孵育時間與對照間無顯著性差異（圖3）。

2.4 SA孵育對早黑寶葡萄葉片兒茶素含量的影響

SA孵育葡萄新梢，兒茶素含量在1 h達到最高峰，兒茶素含量在1、120 h時極顯著高于對照，較對照分別提高了1.55、1.75倍，24 h時顯著高于對照，其他孵育時間與對照間無顯著性差異（圖4）。

2.5 SA孵育對早黑寶葡萄葉片表棓兒茶素含量的影響

SA孵育葡萄新梢，表棓兒茶素含量在24 h出現(xiàn)最高峰，表棓兒茶素含量在3、6、24、72、120、240 h時均極顯著高于對照，較對照分別提高了7.15、10.03、1.50、7.59、12.78、6.43倍，1 h時顯著高于對照，其他孵育時間與對照間無顯著性差異（圖5）。

2.6 SA孵育對早黑寶葡萄葉片表兒茶素含量的影響

SA孵育葡萄新梢，表兒茶素含量在12 h出現(xiàn)最高峰，表兒茶素含量在12 h時極顯著高于對照，較對照提高5.16倍，6、24、72 h時顯著高于對照，其他孵育時間與對照間無顯著性差異（圖6）。

3 討論

本研究結果表明，早黑寶葡萄新梢葉片在離體條件下經(jīng)0.5 mmol/L SA孵育，在0～6 h內，葉片總酚、總類黃酮、總黃烷-3-醇含量高于對照，在短時間內外源水楊酸可促進植物多酚物質積累，這與前人研究結果[18，25]一致。MINA等[26]在切除的倒刺菠菜葉柄中，用一定范圍的水楊酸濃度（0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L）飼喂，結果顯示，0.5 mmol/L飼喂8～10 d是最理想的方法。本研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L SA孵育1 h是最佳方式，與MIN等[26]的研究結果不同，原因可能是孵育材料、外界環(huán)境條件的不同導致最佳孵育時間存在差異。隨SA孵育時間的增長，葡萄葉片的總酚含量、總類黃酮含量、總黃烷-3醇含量下降，這可能與離體葡萄葉片自身的生長代謝有關。

朱越[27]在葡萄葉片發(fā)育過程中檢測到（+）-兒茶素、（-）-表棓兒茶素、（-）-表兒茶素、（-）-表兒茶素沒食子酸酯4種黃烷-3-醇單體。在葉片發(fā)育的所有階段，葉片原花青素延伸亞單位組成都是相似的，表兒茶素是主要的亞單位，其次是表棓兒茶素，還有少量的兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯，本試驗測定的葡萄葉片的黃烷-3-醇含量為0.26～1.20 mg/g，與KHAN等[22]和DOWNEY等[28]的結果相似。本試驗發(fā)現(xiàn)，早黑寶葡萄新鮮葉片中（+）-兒茶素含量最高，（-）-表棓兒茶素含量次之，（-）-表兒茶素含量最少，這與DANI等[29]的研究結果類似。而酯化的黃烷-3-醇如（-）-表兒茶素沒食子酸酯與低聚原花青素在茶樹葉片中積累到非常高的水平[30]，但在葡萄葉片中含量極小，幾乎檢測不到，可能是（-）-表兒茶素沒食子酸酯含量過小而未達到儀器檢測限。

蒸餾水孵育葡萄新梢，兒茶素含量基本處于上下波動狀態(tài)，表棓兒茶素和表兒茶素含量大致表現(xiàn)先升高后下降，表棓兒茶素含量在24 h出現(xiàn)最高峰，而表兒茶素含量在120 h出現(xiàn)最高峰，可能是隨蒸餾水孵育時間的加長，葡萄葉片中的無色花青素合成兒茶素，兒茶素合成原花青素2個階段均趨于相對平穩(wěn)狀態(tài)，而部分表棓兒茶素先于表兒茶素合成原花青素，在后期表棓兒茶素含量先于表兒茶素下降，直至240 h后含量趨于平穩(wěn)。

前人研究表明，花青素還原酶（Anthocyanidin reductase，ANR）和無色花青素還原酶（Leucoanthocyanidin reductase，LAR）對黃烷-3-醇的合成具有特異性，ANR催化花青素轉化為2，3-順式-黃烷-3-醇，即-（-）表兒茶素[31]、（-）-表棓兒茶素和（-）-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯，而LAR催化無色花青素轉化為2，3-反式-黃烷-3-醇，如（+）-兒茶素[32-33]。本試驗發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L SA孵育0～240 h內，葡萄葉片兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素含量基本高于對照，其原因可能是，SA激活了葡萄葉片ANR、LAR活性，從而提高了葡萄葉片兒茶素、表棓兒茶素及表兒茶素含量。在120 h下，SA對葡萄葉片兒茶素、表棓兒茶素含量提高最明顯，且SA對表棓兒茶素含量的影響最大，對兒茶素含量的影響次之，表明SA對合成表棓兒茶素的促進作用大于對合成兒茶素的促進作用。

4 結論

外源0.5 mmol/L SA對葡萄葉片多酚類物質積累具有促進作用，SA處理短時間內可以促進葡萄葉片總酚、總類黃酮、總黃烷-3-醇物質的積累。0.5 mmol/L SA促進葡萄葉片黃烷-3-醇單體積累，特別是對兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素含量積累具有明顯的促進作用，且SA對合成表棓兒茶素的促進作用大于對合成兒茶素的促進作用。