畜禽肉質(zhì)性狀研究中的常用組學(xué)技術(shù)

高夢錦，李 雪，李京京，邢 凱，齊曉龍，王相國，郭 勇，倪和民，盛熙暉

（北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

畜禽良種是畜牧業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，也是提高生產(chǎn)水平和效率的關(guān)鍵。近幾十年，畜禽遺傳改良過分追求生長速度，導(dǎo)致肉質(zhì)下降[1-2]。但隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和消費水平的提高，人們對肉品質(zhì)的要求不斷提升。因此，家畜肉質(zhì)性狀的改良和育種研究已成為畜牧科學(xué)研究的熱點之一。肉質(zhì)是指與肉品外觀和適口性相關(guān)的特性，其主要影響因素可歸納為遺傳和環(huán)境2 個方面。研究人員可以利用組學(xué)技術(shù)挖掘肉質(zhì)性狀的調(diào)控基因或蛋白，深入了解肉質(zhì)性狀調(diào)控機理，為下一步開展肉質(zhì)性狀改良奠定理論基礎(chǔ)。在肉質(zhì)評定方面，常用的指標有pH 值、肉色、系水力、嫩度等。但是目前國內(nèi)外對畜禽肉質(zhì)評定標準還未完全統(tǒng)一，研究者對肉質(zhì)指標的評定方法和條件各有不同，不同試驗結(jié)果之間的可比性較差，組學(xué)技術(shù)或可為解決此問題提供新思路。組學(xué)技術(shù)包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等，目前其已成為畜禽肉質(zhì)性狀研究的有力工具，在畜禽肉質(zhì)性狀及調(diào)控機理研究中應(yīng)用廣泛。本文綜述了組學(xué)技術(shù)在畜禽肉質(zhì)性狀研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對其前景進行了展望。

1 基因組學(xué)技術(shù)

基因組學(xué)旨在研究基因組的結(jié)構(gòu)和功能，主要包括結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)2 個方面。2000 年，人類基因組計劃完成，隨后紅原雞、海福特牛、杜洛克豬等家畜也先后完成了基因組測序工作[3]，為家畜育種研究提供了重要的基因組信息。目前，基因組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用在畜禽肉質(zhì)性狀育種研究中，主要包括基因芯片和基因組重測序等。

1.1 基因芯片 基因芯片運用核酸互補雜交原理，在載體表面有規(guī)則地構(gòu)建DNA“探針”陣列，探針將與同位素或熒光標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交圖譜熒光信號強弱可測定樣品中目的基因的數(shù)量及組成[4]。在家養(yǎng)動物肉質(zhì)研究中，Kaifan 等[5]比對了藍塘豬和大白豬的脂肪酸含量及其組成，并用微陣列技術(shù)和實時定量PCR 技術(shù)確定了影響其脂肪酸組成的候選基因。Hausman 等[6]運用Affymetrix 基因芯片對不同周齡科寶肉雞的腹部脂肪組織進行基因微陣列分析，共篩選出330 個差異表達基因，這些基因可作為腹部脂肪沉積調(diào)控研究的候選基因?；蛐酒c生物信息學(xué)的結(jié)合使研究人員從最初1 個月測序1 個或2 個基因到現(xiàn)在幾個小時即可研究數(shù)萬個基因，加快了肉質(zhì)性狀研究中挖掘差異表達基因的進程，節(jié)約了大量的時間成本。

1.2 全基因組重測序技術(shù) 全基因組重測序技術(shù)是在已知物種基因序列的基礎(chǔ)上，通過比較該物種不同個體基因組之間的差異，運用各種生物信息學(xué)技術(shù)分析變異信息，進而研究其遺傳變異和分子標記。在家畜肉質(zhì)性狀的研究中，Kong 等[7]以雞高/低肌肉顏色品系和隨機繁殖對照系為研究對象，利用Illumina 測序平臺對每個品系各10 只雞進行全基因組重測序挖掘雞肉中負責調(diào)節(jié)肌肉顏色的遺傳變異，共鑒定出數(shù)百萬個單核苷酸多態(tài)性，其中有15 個與肌肉顏色顯著相關(guān)。Li 等[8]利用全基因組重測序技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)比對西藏野豬、家豬和普通野豬的SNP 變異信息，研究發(fā)現(xiàn)在人工選擇下共有516 個候選基因與家豬的生長、肌肉發(fā)育、嗅覺和免疫反應(yīng)等生物過程有關(guān)。毛衍偉等[9]運用全基因組重測序技術(shù)對高/低脂肪含量安格斯?！料嬷悬S牛雜交牛的背最長肌進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪形成基因、能量代謝基因等基因的多態(tài)性變化是影響肉牛肌內(nèi)脂肪沉積能力的關(guān)鍵。全基因組重測序技術(shù)是一次性獲得大量且具有高分辨率數(shù)據(jù)的最佳方法，能夠在全基因組水平上找到與肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳變異位點，與此同時，對所獲得大量數(shù)據(jù)的分析及處理尤為關(guān)鍵。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)

RNA 在遺傳信息從DNA 傳遞到蛋白質(zhì)的過程中起到了承上啟下的作用，所以轉(zhuǎn)錄組學(xué)是功能基因組學(xué)的一個重要方面[10]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)又稱為基因表達圖譜，可以通過基因芯片、轉(zhuǎn)錄組測序和基因表達序列分析等技術(shù)研究某一特定條件下細胞或組織基因表達情況，并利用生物信息學(xué)方法進行數(shù)據(jù)處理和分析。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已廣泛用于肉質(zhì)相關(guān)基因的調(diào)控研究。

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序 皮下、肌間和肌內(nèi)脂肪是影響肉質(zhì)的重要因素之一。Jung 等[11]對豬肝臟組織進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，非同義單核苷酸變異可通過影響死后代謝相關(guān)基因表達的表觀遺傳調(diào)控進而影響多種肉質(zhì)性狀。Piórkowska 等[12]對兩組剪切力存在顯著差異的哈伯德FLEX 系列肉雞的胸肌組織進行全轉(zhuǎn)錄組測序，初步篩選出了與雞胸肌肌肉轉(zhuǎn)化、脂肪生成和膠原合成有關(guān)的基因。為探索高濃度氨對肉雞肉質(zhì)的影響，Yi 等[13]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較了暴露于不同氨濃度下的愛拔益加肉雞胸肌的轉(zhuǎn)錄組，共鑒定出了267 個候選基因，這些基因都參與了脂質(zhì)代謝過程。Billerey 等[14]采集了9頭利木贊公牛的背最長肌樣本，利用全轉(zhuǎn)錄組測序方法鑒定出超過500 種的lncRNA，這些lncRNA 可能有助于肉質(zhì)性狀遺傳變異的相關(guān)研究。Sodhi 等[15]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究了濟州島本地豬與巴克夏豬脂肪組織的差異表達基因，這些基因為進一步研究豬的脂肪沉積機制奠定了基礎(chǔ)。Li 等[16]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對白來航雞的骨骼肌進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了新型lncRNA，結(jié)合RT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA gga-lnc-0181 在骨骼肌中高度表達。利用轉(zhuǎn)錄組測序可以有效獲得肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因編碼序列，因只研究被轉(zhuǎn)錄的基因，其相較于基因組學(xué)而言針對性更強。

2.2 小分子RNA 測序 生物體細胞內(nèi)存在著大量的小分子RNA，包括小片段干涉RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、Piwi 蛋白相互作用RNAs（piRNAs）、核仁小RNA（snoRNA）和核內(nèi)小RNA（snRNA），其作為生命活動重要的調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控、生物體的生長發(fā)育、疾病、代謝及生殖等方面發(fā)揮著重要作用。microRNA 是一種內(nèi)源性的非編碼小RNAs，轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控基因表達。越來越多的證據(jù)表明，microRNA 在體外和體內(nèi)脂肪生成過程中起著重要作用，并且對家畜肉品質(zhì)有影響[17-20]。Zhang 等[21]以6 只固始母雞為研究對象，分別測定了3 只20 周齡雞（G20W 組）和3 只55 周齡產(chǎn)蛋后期母雞（G55W 組）右側(cè)胸肌的肌內(nèi)脂肪含量，并提取了左側(cè)胸肌、肝臟、心臟、脾臟、肺、腎、十二指腸、卵巢和腹部脂肪組織的RNA 進行miRNA 測序，研究結(jié)果表明，與G20W組相比，G55W 組右側(cè)胸肌肌內(nèi)脂肪含量較高，其總miRNA 表達水平低，2 組共鑒定出104 個差異表達miRNA。為更好地理解miRNA 在牛脂肪沉積中的差異表達和機制，Wang 等[22]通過微陣列分析了6 頭成年肉牛肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪的差異miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-145、miR-26a、miR-2373-5p 和miR-23b-3p 在肌內(nèi)脂肪中高表達，而miR-26a、miR-2373-5p、miR-2325c、miR-3613 和miR -2361 在皮下脂肪中豐度最高。目前，小分子RNA 測序技術(shù)在畜禽肉質(zhì)方面的研究主要集中于miRNA，對于其他小分子RNA 還有待研究。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)于1994 年由澳大利亞麥考瑞大學(xué)的Wilkins 和Williams 提出，用來描述對特定蛋白質(zhì)組的研究，它是在特定生理條件下和特定時間由生物系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的整個復(fù)合體[23]。蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，因此蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以更有效地闡明生命過程的分子機制。在畜牧科學(xué)研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)是診斷畜禽疾病，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、安全的動物產(chǎn)品，提高動物生產(chǎn)效率的有力手段。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以鑒定與肌肉品質(zhì)指標相關(guān)的蛋白質(zhì)，全面深入地研究肉質(zhì)性狀的形成機制。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)主要包括如下3 種。

3.1 雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù) 雙向凝膠電泳作為最廣泛使用的蛋白質(zhì)分離方法之一，其原理是蛋白質(zhì)根據(jù)第一維度中的等電點和第二維度中的分子量通過兩次電泳將其分離[24]。質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度和準確性，極大地擴展了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。在運用雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)之后，凝膠點可以被分開切除并進行隨后的蛋白質(zhì)溶解消化。消化后產(chǎn)生的肽段混合物可利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)或肽段。利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，D'Alessandro 等[25]在牛肉中發(fā)現(xiàn)了3 個與嫩度相關(guān)的標記蛋白質(zhì)。曹夢等[26]通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用分析白萊航、快大黃雞和北京油雞的肌肉組織蛋白表達差異，研究發(fā)現(xiàn)11 個蛋白表達差異點，其中3 種蛋白表達差異極顯著。趙珺[27]對3 只成年內(nèi)蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出了骨骼肌的3 種差異蛋白并建立了絨山羊骨骼肌差異蛋白譜。雙向凝膠電泳在畜禽蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用已較為成熟，隨著質(zhì)譜靈敏度的提高，其已成為首選的分離方法。

3.2 同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù) iTRAQ技術(shù)作為一種新型蛋白質(zhì)標記定量技術(shù)，可同時對4 個或8 個不同樣品進行蛋白定量比較，并且能對樣本中的幾乎所有蛋白質(zhì)進行結(jié)合，標記過程更簡單，與質(zhì)譜儀串聯(lián)檢測更靈敏[28]。相比于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳分析，iTRAQ 技術(shù)可以提供更可靠的定量測定和樣品比較[29]。Wang 等[30]以6 月齡藏豬、滇南小耳豬、約克夏豬和長白豬為研究對象，利用iTRAQ 技術(shù)初步篩選出了調(diào)控豬背最長肌脂肪代謝、沉積和肌肉生長的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。付睿琦[31]利用iTRAQ 技術(shù)獲得不同發(fā)育階段北京油雞的胸肌肌肉發(fā)育和脂肪代謝主要途徑和關(guān)鍵蛋白。王紅楊[32]以胚胎期至生長早期北京油雞和科寶肉雞為研究對象，利用iTRAQ 技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)對雞胸肌組織蛋白表達情況進行分析獲得與肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)關(guān)鍵蛋白和通路。郝瑞杰[33]以雪龍黑牛、云嶺牛、秦川肉牛和傳統(tǒng)秦川牛為研究對象，利用iTRAQ 技術(shù)分析其背最長肌的蛋白質(zhì)，結(jié)果共篩選到了6 個與脂肪細胞增殖和分化相關(guān)的蛋白質(zhì)，初步推測了肌內(nèi)脂肪沉積的可能調(diào)控機理。Bjarnadottir 等[34]利用iTRAQ 技術(shù)研究挪威紅公牛背最長肌低剪切力組與高剪切力組，發(fā)現(xiàn)了3 個與嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)。目前，iTRAQ 技術(shù)與多維液相及色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已在蛋白質(zhì)組學(xué)中廣泛應(yīng)用，其在獲取樣本中差異蛋白及挖掘生物標記物等方面具有優(yōu)勢。

4 代謝組學(xué)技術(shù)

代謝組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的進一步延伸，用于研究某一生物或細胞的代謝路徑底物和產(chǎn)物變化規(guī)律，尤其是小分子代謝物質(zhì)，揭示生物生命活動代謝的本質(zhì)[35]。由于代謝產(chǎn)物種類繁多并且不能像基因、蛋白質(zhì)一樣根據(jù)堿基、氨基酸來測序，目前還未有一種可以同時分析所有代謝產(chǎn)物的方法，一般是根據(jù)代謝產(chǎn)物的類型和研究目的來選擇不同的分析方法，較為常見的分析方法有色譜、質(zhì)譜、核磁共振、紫外吸收、放射性檢測及紅外光譜等[36-37]。現(xiàn)今，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于植物、食品、醫(yī)藥及疾病診斷等領(lǐng)域，并取得了豐碩的成果。在畜禽肉質(zhì)性狀研究中，目前對牛和豬的研究較多，并主要集中于代謝分子全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（Genome-Wide Association Studies with Metaotypes,mGWAS），用于篩選影響肉質(zhì)的遺傳標記或重要候選基因。例如，F(xiàn)ASN和SCD基因與牛背最長肌的中、長鏈脂肪酸含量顯著相關(guān)[38-39]，ELOVL等重要候選基因與豬背最長肌中脂肪酸含量顯著相關(guān)[40]。

5 展 望

各種組學(xué)技術(shù)以及多組學(xué)聯(lián)合技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜禽肉質(zhì)性狀的研究領(lǐng)域，為全面深入地探索畜禽肉質(zhì)性狀的調(diào)控機制提供了新思路?；蚪M學(xué)通過對畜禽重要經(jīng)濟性狀位點的研究可大幅度提高養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效益，目前標記輔助選擇等分子育種技術(shù)已經(jīng)運用于畜禽育種實踐中。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可從RNA 水平上整體分析不同組織或生理狀況下所有基因的表達，分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有助于得到新的功能基因和代謝通路，為畜禽育種提供新思路?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析，可以建立蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫、挖掘低表達基因并比較樣本間表達差異蛋白。在育種過程中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有助于確定動物經(jīng)濟性狀候選基因，從而加快育種進程。相較于其他組學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)尚處于新生階段，在檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)分析等方面仍需進一步完善，但代謝組學(xué)在遺傳育種中已表現(xiàn)出巨大潛能，如通過mGWAS 篩選特定標記代謝分子。與此同時，各種組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合使用對數(shù)據(jù)分析方法提出了新挑戰(zhàn)。未來，隨著組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，這些技術(shù)將更廣泛地應(yīng)用于畜禽肉質(zhì)性狀的選育及其遺傳機制的闡明。