孟憲玉，楊曉敏*

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014000）

引言：大鼠心肌細(xì)胞的分離鑒定以及培養(yǎng)工作已經(jīng)有五十多年的歷史，但是心肌細(xì)胞的分離、鑒定、培養(yǎng)上還存在一定的局限性。在這樣的情況下，加強對分離培養(yǎng)技術(shù)的探索，有效延長心肌細(xì)胞的生長、存活的時間，可以為心肌細(xì)胞的研究工作提供更好的研究樣本，為國家的基因研究做出貢獻(xiàn)。

1 試驗材料

為了保證得到的結(jié)果科學(xué)有效，試驗中選擇了某大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供的健康大鼠，同時準(zhǔn)備了Sigma公司的I型膠原酶、胰蛋白酶、Na2ATP，MgATP、阿糖胞苷等分析材料。除此之外，還準(zhǔn)備了無鈣Tyrode液、正常Tyrode液、酶液、細(xì)胞保存液，并且用NaOH將這些液體的pH調(diào)節(jié)值至7.38，為了保證細(xì)胞培養(yǎng)工作的順利進行，在試驗前還采用了GIBCO公司的優(yōu)級胎牛血清（FCM）和DMEM/F12培養(yǎng)基等材料。

2 試驗方法

2.1 單個心肌細(xì)胞的分離

本文采用酶消化法分離單個心肌細(xì)胞，在進行心肌細(xì)胞分離的過程中，首先，要讓大鼠脫臼昏厥。朝大鼠腹腔內(nèi)注射肝素500 U/kg，五分鐘后大鼠就會在肝素的作用下昏厥。其次，要取出大鼠心臟。用剪刀剪開大鼠胸腔后，讓心臟充分暴露出來，并且將心臟劍俠，放置在4℃的生理鹽水中清理。再次，要對大鼠心臟進行灌流。采用心臟離體灌流裝置，對心臟主動脈進行逆行插管并且縫線扎緊，同時用還要對其進行預(yù)熱，當(dāng)溫度在37℃時，就可以正式進行主動脈逆行灌流。需要注意的是在這個環(huán)節(jié)中，要保證灌流速度在9～10 mL/min范圍內(nèi)。逆行灌流的過程中，涉及無鈣Tyrode液、正常Tyrode液、酶液這三種液體，液體順序、時間各不相同，其中酶液最后灌注且灌注時間最長。最后，要完成保存處理。在完成灌流后，剪下心室保存在準(zhǔn)備好的細(xì)胞保存液中并剪碎，需要注意的是，至少要靜置一小時后，才能夠應(yīng)用到細(xì)胞實驗中，在一小時內(nèi)，心室碎片在室溫下可以更好完成復(fù)鈣任務(wù)。

2.2 細(xì)胞記錄方法和形式

在室溫保存一個小時后，大鼠心室肌細(xì)胞就可以放置在正常勝利濃度鈣中，想要具體檢測耐鈣心室肌細(xì)胞個數(shù)，可以通過高倍或者低倍鏡，計算得到桿狀細(xì)胞總數(shù)以及球形細(xì)胞總數(shù)，然后利用桿狀細(xì)胞總數(shù)除以上述兩種細(xì)胞之和，就可以得到具體的個數(shù)數(shù)據(jù)。

2.3 心肌細(xì)胞的培養(yǎng)觀察

除了要對細(xì)胞進行分離的之外，還要對細(xì)胞進行培養(yǎng)觀察，最佳的傳代培養(yǎng)時間在細(xì)胞生長增殖至培養(yǎng)板的80%～90%這一階段。首先要將培養(yǎng)液吸去，利用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對細(xì)胞進行沖洗，一般情況下要沖洗2～3次；其次要在每個孔內(nèi)添加0.25%的胰蛋白酶200 μL，等待3～5分鐘，待細(xì)胞的完全消化吸收后，在進行下一階段的操作；再次在每個孔內(nèi)加入20%的FBSDMEM/F12培養(yǎng)液，在這個過程中，要將細(xì)胞吹起并打勻，然后就可以按照1：2的比例進行傳代培養(yǎng)工作；最后，將得到細(xì)胞的放置在溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時后，將20%的FBSDMEM/F12培養(yǎng)液更換為10%的FBSDMEM/F12培養(yǎng)液。經(jīng)過上述處理后，就可以利用顯微鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞的成長狀態(tài)和形態(tài)特征，需要注意的是在觀察的過程中，要實時測定大鼠心肌細(xì)胞的搏動次數(shù)。

2.4 心肌細(xì)胞的化學(xué)鑒定

本文以免疫組織化學(xué)鑒定過程為例，在實際鑒定過程中，一共分為四個環(huán)節(jié)，第一個環(huán)節(jié)，將大鼠心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)后得到的細(xì)胞放置在0.25%胰蛋白酶中，讓其消化、吹散；第二個環(huán)節(jié)，待細(xì)胞消化吹散后，將其移入6孔板中，并且在孔板內(nèi)設(shè)置無菌蓋玻片，進而將溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)；第三個環(huán)節(jié)，靜置48小時后，無菌蓋玻片上會長滿細(xì)胞，將蓋玻片去除放入平皿中，加入固定液，固定25分鐘后利用PBS反復(fù)沖洗3次，每次控制在3分鐘左右；第四個環(huán)節(jié)，按照順序，依次對無菌蓋玻片滴加科學(xué)設(shè)計的濃度配比的過氧化酶阻斷溶液、羊血清、ɑ-actin抗體、生物素標(biāo)記羊抗小鼠抗體、鏈霉菌抗生物素、過氧化物酶溶液，每次滴加液體后，都要在室溫下孵育10分鐘，其中ɑ-actin抗體較為特殊，需要孵育60分鐘，最終加入新鮮配制的DAB顯色液并且完成封片后，就可以進行觀察[1]。

3 試驗結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

按照具體的步驟完成試驗過程后，將得到大鼠心肌細(xì)胞倒置在顯微鏡下進行觀察，記錄不同時間節(jié)點下，大鼠心肌細(xì)胞的生長和形態(tài)狀態(tài)，結(jié)合大鼠心肌細(xì)胞的搏動次數(shù)，最終得到了不同培養(yǎng)時間后（8小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、7～10天、40天、45天）在倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞。8小時后，細(xì)胞就會逐步的貼壁生長；24小時后，細(xì)胞均已貼壁，并且從圓形或卵圓形轉(zhuǎn)變扁平形、梭形，還有部分細(xì)胞會呈現(xiàn)出三角形，且頂部較為突出。48小時后，研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)了自發(fā)性脈搏搏動，雖然整體搏動節(jié)律較為緩慢，但是搏動持續(xù)，每分鐘平均搏動8～10次；72小時后，細(xì)胞逐漸生長開，搏動也日益明顯，可以達(dá)到每分鐘60次，部分細(xì)胞會伸出偽足，形狀從扁平形、梭形、三角形，變?yōu)椴灰?guī)則星形，可能會出現(xiàn)多個、單個細(xì)胞核，但是單個細(xì)胞核的情況較多，細(xì)胞核為原型，核仁較為清晰；96小時后，大部分細(xì)胞都會生出偽足，且較為清晰民享，細(xì)胞搏動頻率更加明顯，的平均次數(shù)增加，絕大部分細(xì)胞都會變成不規(guī)則星形。120小時后，細(xì)胞形成細(xì)胞簇，細(xì)胞簇會出現(xiàn)同步搏動的情況。7～10天后，就可以開始傳代培養(yǎng)，每三天開展一次傳代培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸成熟。40天～45天，開始逐漸出現(xiàn)細(xì)胞變性死亡的情況[2]。

3.2 檢測的結(jié)果

經(jīng)過間接免疫熒光檢測以及免疫組織化學(xué)鑒定的情況來看，通過陰性對照結(jié)果來看，加入cTnT抗體的小鼠心肌細(xì)胞在胞膜和胞漿中均呈綠色熒光，也就是說，cTnT抗體呈陽性。同時根據(jù)免疫組織化學(xué)鑒定的情況來看，心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)在七天后，就進行了ɑ-actin抗體檢測，檢測結(jié)果呈陽性反應(yīng)，肌原纖維較為清晰。綜合這兩種鑒定檢測結(jié)果可以得出，大鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的過程中，生物特性不會發(fā)生改變，受到一些生長因子的影響，一些細(xì)胞在離體后可以存活40～120天，部分生長力較為旺盛的細(xì)胞可以持續(xù)培養(yǎng)1年左右。也就是說大鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)可以在細(xì)胞學(xué)、動物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)中得到應(yīng)用，還需要注意的是，因為本文采用的是酶消化法分離單個心肌細(xì)胞方法，除了這種分離培養(yǎng)方法之外，還有很多其他的方法，這些方法各具優(yōu)缺，因此要根據(jù)實際需求，科學(xué)的選擇分離培養(yǎng)方式，比如：消化培養(yǎng)法在實際應(yīng)用中，雖然操作便捷，但得到的細(xì)胞較少[3]。

總結(jié)：綜上所述，通過對大鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定研究，對大鼠的心肌細(xì)胞有了全面的了解，作為生物醫(yī)學(xué)實驗研究中最常使用的品種，在日后還需要進一步加強對其的研究分析工作。