蔣棟 康鵬程 肖炯哲 李騰飛 李洵 任煉 成世高 趙會

作者單位：417000 湖南，南華大學附屬婁底醫(yī)院、湖南省婁底市中心醫(yī)院骨科 (蔣棟、康鵬程、肖炯哲、李騰飛、李洵、任煉、成世高)；100020 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院骨科 (趙會)

骨肉瘤 (osteosarcoma，OS) 是一種間葉源性的惡性腫瘤，其發(fā)病率占原發(fā)性惡性骨腫瘤的首位[1]。骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后差，腫瘤切除聯(lián)合肢體修復(fù)重建術(shù)后患者的 5年生存率為 65%～75%[2]，有轉(zhuǎn)移患者的 5年生存率僅為 20% 左右[3]。目前，對骨肉瘤發(fā)病機制及病因?qū)W的研究尚不明確。研究表明，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與某些原癌基因的異常激活和抑癌基因的異常失活以及相關(guān)調(diào)控因子的失常密切相關(guān)。

Twist 是一種癌基因[4]，其基因異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，影響腫瘤細胞的凋亡，而且還是上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)變 (epithelial mesenchymal transition，EMT) 過程中的關(guān)鍵因子，對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著重要影響[5]。Twist 的表達水平與腫瘤各亞型的惡性程度密切相關(guān)，浸潤性越強表達越高，惡性程度也越高，增加 Twist 表達會提高腫瘤 EMT 能力[6]。目前，僅少量報道 Twist 在骨肉瘤中存在高表達，但對 Twist 與骨肉瘤關(guān)系更深入的研究尚未見報道，仍有較大的研究空間和研究意義。

E-cadherin 介導(dǎo)的細胞間黏附作用的喪失是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要起始步驟，故被認為是一種抑癌基因[7]。E-cadherin 表達下調(diào)、紊亂或缺失都將導(dǎo)致細胞－細胞間黏附解體，腫瘤細胞脫落，侵襲力增強。Twist 可下調(diào) E-cadherin 的表達誘導(dǎo) EMT 的發(fā)生。

在許多上皮來源性惡性腫瘤中 Twist 與 E-cadherin表達呈負相關(guān)，Twist 高表達可下調(diào) E-cadherin 表達，從而促使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差。相反，在 Twist 低表達腫瘤組織內(nèi) E-cadherin 相對高表達，腫瘤細胞間粘連相對穩(wěn)定，腫瘤細胞不易移動，患者預(yù)后相對較好[8-10]。而對來源性于間葉組織的骨肉瘤中是否 Twist 的表達水平與各惡性程度亞型密切相關(guān)；是否 Twist 與 E-cadherin 的表達在骨肉瘤中呈負相關(guān)。目前尚未見報道，需進一步研究。

本研究用免疫組化檢測 Twist 及 E-cadherin 在人骨肉瘤、骨軟骨瘤組織中的表達情況，研究以上兩種基因在不同病理分級與分型骨肉瘤組織的表達情況、在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移骨肉瘤組織的表達情況，并研究 Twist 與 E-cadherin 的相關(guān)性。共同探討 Twist與 E-cadherin 在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學意義，為進一步闡明骨肉瘤的發(fā)病機制、早期診斷、判斷預(yù)后和基因治療提供理論和實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

一、納入標準與排除標準

1. 納入標準：(1) 2012年6月至 2018年11月，婁底市中心醫(yī)院等 4 家三甲醫(yī)院 (婁底市中心醫(yī)院 10例，湘雅二院 13例，岳陽市二院 16例，解放軍第 169 中心醫(yī)院 11例) 經(jīng)治的骨肉瘤標本；(2) 有明確的病理診斷者；(3)年齡在 5～80 歲之間；(4) 男女均可；(5) 所有患者均接受同一骨肉瘤標準治療方案。

2. 排除標準：(1) 取標本前已經(jīng)大劑量化療等抗腫瘤藥物治療者；(2) 已發(fā)生肺轉(zhuǎn)移等遠處轉(zhuǎn)移者；(3) 合并其它惡性腫瘤者；(4) 治療前合并嚴重心肝腎等功能衰竭者；(5) 圍術(shù)期死亡者。

二、研究對象資料

1. 骨肉瘤組：本研究共納入 4 家醫(yī)院截肢、腫瘤切除或手術(shù)切取活檢的人骨肉瘤標本 50例。其中男 36例，女 14例，年齡 6～76 歲，平均 26.14歲；其中股骨 19例，脛骨 12例，肱骨 7例，腓骨6例，上 (下) 頜骨 5例，跟骨 1例。所有標本均經(jīng)2 位資深病理科醫(yī)師確認 (圖 1～6)。

對所有骨肉瘤標本在 HE 染色下按病理組織學分型為：骨母細胞型骨肉瘤、軟骨母細胞型骨肉瘤、纖維母細胞型骨肉瘤和混合型骨肉瘤四種[11]。其中含骨母細胞型骨肉瘤 12例：異型性骨母細胞為其主要成分，一般伴有豐富的瘤骨形成；軟骨母細胞型骨肉瘤 13例：瘤組織中有一半以上呈軟骨肉瘤樣結(jié)構(gòu)，并有化生骨質(zhì)形成，而且有直接形成類骨或瘤骨的梭形瘤細胞；纖維母細胞型骨肉瘤 18例：瘤組織中一半以上呈纖維肉瘤樣結(jié)構(gòu)，由束狀及緊密編織狀排列的梭形瘤細胞組成，但瘤細胞間可見少量腫瘤性骨質(zhì)或骨樣組織形成；混合型骨肉瘤7例：是指由以上兩種或三種類型等量混合組成，其它特殊類型骨肉瘤也歸為此類。

圖1 骨母細胞型骨肉瘤 (I 級) (HE × 400) Fig.1 Osteoblastic osteosarcoma (grade I) (HE × 400)

圖2 軟骨母細胞型骨肉瘤 (II 級) (HE × 400) Fig.2 Chondroblast osteosarcoma (grade II) (HE × 400)

圖3 纖維母細胞型骨肉瘤 (III 級) (HE × 400) Fig.3 Fibroblast osteosarcoma (grade III) (HE × 400)

圖4 混合型骨肉瘤 (II 級) (× 100) Fig.4 Mixed osteosarcoma (grade II) (× 100)

圖5 混合型骨肉瘤 (II 級) (× 400) Fig.5 Mixed osteosarcoma (grade II) (× 400)

圖6 骨軟骨瘤 (HE × 100) Fig.6 Osteochondroma (HE × 100)

將 50例骨肉瘤根據(jù)瘤細胞的病理組織學特征，將其惡性程度分為 I、II、III 級[12]，其中 I 級13例：視野中瘤巨細胞較少，富含骨樣組織，瘤細胞略呈異型性改變，核分裂相少見，每個高倍鏡視野僅見 0～1 個；II 級 20例：瘤巨細胞多，中等量骨樣組織，瘤細胞分化較差，具有一定的異型性，核分裂相較多，每個高倍鏡視野見 2～3 個；III 級17例：瘤巨細胞較多，僅含少量骨樣組織，瘤細胞分化差，具有明顯的異型性改變，核分裂相多見，每個高倍鏡視野見 3 個以上。

所有骨肉瘤患者術(shù)后經(jīng)電話聯(lián)系和搜索復(fù)查病歷資料隨訪，術(shù)后發(fā)生肺轉(zhuǎn)移等遠處轉(zhuǎn)移或術(shù)后2年內(nèi)非其它病因死亡者均歸為轉(zhuǎn)移組，共 29例；術(shù)后未發(fā)生轉(zhuǎn)移且生存期限超過 2年者另歸非轉(zhuǎn)移組，共 13例；失訪 8例。

2. 骨軟骨瘤組：收集 2012年6月至 2018年11月間婁底市中心醫(yī)院骨科手術(shù)切除的 12例人骨軟骨瘤新鮮標本。其中男 6例，女 6例，年齡 3～53 歲，平均 22.08 歲；股骨 6例，脛骨 4例，手指、足趾各 1例。所有標本經(jīng)兩位資深病理科醫(yī)師對 HE 切片進行復(fù)診確認。

三、實驗主要試劑及儀器

兔抗人 Twist (濃縮型) 多克隆抗體 (北京博奧森公司編號：bs-2441R-AF680)、鼠抗人 E-cadherin(即用型) 單克隆抗體 (福州邁新公司編號：MAB-0589)、鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶法 (streptavidin-peroxidase，SP) 超敏免疫組化試劑盒 (福州邁新公司編號：KIT-9720)、石蠟包埋機 (孝感市泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司型號：BM450B)、病理組織切片機 (英國 SHANDON 公司型號：AS325)、光學顯微鏡 (日本 Olympus 公司型號：BX41)、超清晰度病理圖文分析系統(tǒng) (日本 Olympus 公司型號：PIPS-2020)。

四、實驗方法

本實驗研究中對 Twist 和 E-cadherin 蛋白的表達均采用 SP 法檢測。

免疫組織化學染色 (SP 法) 步驟：(1) 烤片：將烤箱調(diào)至 60 ℃ 烤片 3 h；(2) 脫蠟：二甲苯 I、二甲苯 II 每缸浸泡脫蠟 20 min；(3) 水化：依次經(jīng)過無水乙醇 I、II、95%、90%、80%、70% 乙醇各5 min，蒸餾水洗 5 min；(4) PBS 漂洗 5 min×3 次；(5) 微波修復(fù)：pH6.0 檸檬鹽酸緩沖液 (＞500 ml) 置微波盒煮沸，放入切片后中高檔微波修復(fù) 15 min，切片和緩沖液一起自然涼至室溫。PBS 洗 5 min×3 次；(6) 滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3% 甲醇-H2O2(SP 試劑盒中試劑 A) 室溫 20 min，PBS 洗 5 min×3 次；(7) 非免疫血清封閉：正常山羊血清 (SP 試劑盒中試劑 B) 封閉，37 ℃ 20 min，甩去余液，不洗；(8) 滴加一抗：滴加一抗 (E-Cad / Twist，預(yù)實驗摸索 Twist 兔抗人多克隆抗體最適濃度為 1∶200)孵育，濕盒置 4 ℃ 冰箱過夜；(9) 復(fù)溫 20 min，PBS洗 5 min×3 次；(10) 滴加二抗：滴加二抗 (SP 試劑盒中試劑 C) 孵育，37 ℃ 20 min (二抗為生物素標記的羊抗兔 / 鼠 IgG)，PBS 洗 5 min×3 次；(11) 滴加三抗：滴加三抗 (SP 試劑盒中試劑 D) 孵育，37 ℃20 min (三抗為辣根酶標記的鏈酶親和素)，PBS 洗5 min×3 次；(12) DAB 顯色：按標準說明書配置DAB 顯色液，滴加于切片上，鏡下觀察結(jié)果，控制染色結(jié)果，適時用蒸餾水沖洗終止；(13) 復(fù)染：置蘇木素中 5 min，自來水沖洗片刻，75% 的鹽酸酒精溶液分化 30 s，自來水沖洗 5 min 藍化；(14) 脫水和透明：依次經(jīng)過 70%、80%、90%、95%、無水乙醇，各 5 min，二甲苯 I、II 各透明 10 min；(15) 封片、鏡檢：滴中性樹脂蓋片，鏡下觀察、記錄并攝片。

五、主要觀察指標

Twist 和 E-cadherin 在每個切片組織中的表達情況和強度。每張切片均由 2 名資深病理診斷醫(yī)師在雙盲下獨立觀察。瘤細胞呈黃色、棕黃色或棕褐色均為陽性表達。

Twist 陽性結(jié)果判定標準：染色顆粒主要位于細胞質(zhì)中，少數(shù)細胞核中亦有表達。在顯微鏡 10×40倍視野下，每張切片隨機選取 10 個非重疊視野按陽性細胞所占比例分為：0%～25% 為弱陽性 (+)，25%～50% 陽性 (++)，＞50% 為強陽性 (+++)。視細胞未著色或背景均勻一致淡黃色為陰性 (－)。

E-Cad 染色結(jié)果判定標準：陽性染色顆粒主要位于胞膜和胞質(zhì)中且以胞質(zhì)中為主。在顯微鏡10×40 倍視野下，每張切片隨機選取 10 個非重疊視野按陽性細胞表達部位和所占比例分為：陽性：定位于包膜或胞漿者，其中 0%～25% 為弱陽性 (+)，25%～50% 陽性 (++)，＞50% 為強陽性 (+++)；陰性 (－)：細胞無著色或背景一致性淡棕色者。

六、統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件 SPSS 23.0 對實驗數(shù)據(jù)進行分析，運用 Chi-square 和 Fisher’s 確切法進行χ2檢驗比較兩組間的陽性率；運用成組設(shè)計兩個樣本比較的秩和檢驗 (Mann-WhitneyU法) 比較各抗體在骨肉瘤、骨軟骨瘤組織的表達強度；運用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗 (Kruskal-WallisH法) 比較各抗體在骨肉瘤 4 種不同病理組織分型中的陽性率；運用 Spearman 等級相關(guān)非參數(shù)檢驗，分析 Twist 和E-cadherin 兩者在骨肉瘤中表達的相關(guān)關(guān)系。以上均以 α＝0.05 作為檢驗水準。

結(jié) 果

一、Twist 在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達

Twist 在骨腫瘤細胞中陽性染色部位主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)胞核中有表達，為棕黃色，顯色過強時為棕褐色，可見細小顆粒 (圖 7～12)。

50例骨肉瘤組織和 12例骨軟骨瘤組織中 Twist表達的陽性率和表達強度比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) (表 1，圖 19)。

二、骨肉瘤中 Twist 表達與其病理分型和分級的關(guān)系

1. Twist 表達與病理分型的關(guān)系：在骨肉瘤 4 種不同病理分型中 Twist 表達的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05) (表 2，圖 20)。

表1 Twist 在骨肉瘤和骨軟骨瘤組中的表達情況Tab.1 Expressions of Twist in osteosarcoma and osteochondroma

表2 Twist 在骨肉瘤不同病理組織類型的表達情況Tab.2 Twist expressions in different osteosarcoma pathological tissues

2. Twist 表達與病理分級的關(guān)系：本研究中，將根據(jù)骨肉瘤的惡性程度分為 3 級，其中把 I 級列為低級別骨肉瘤組，把 II、III 級列為高級別骨肉瘤組。低級別與高級別兩組中 Twist 表達的陽性率和表達強度比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) (表 3，圖 21)。

圖7 Twist 在骨肉瘤中陽性表達 (×100) Fig.7 Positive expressions of Twist in osteosarcoma (× 100)

圖8 Twist 在骨肉瘤中陽性表達 (× 400) Fig.8 Positive expressions of Twist in osteosarcoma (× 400)

圖9 Twist 在骨肉瘤中陰性表達 (× 400) Fig.9 Negative expressions of Twist in osteosarcoma (× 400)

圖10 Twist 在骨軟骨瘤中陽性表達 (× 100) Fig.10 Positive expressions of Twist in osteochondroma (× 100)

表3 Twist 在骨肉瘤低級 (I 級) 與高級 (II、III 級) 組的表達情況Tab.3 Twist expressions of osteosarcoma (grade I; grade II, III)

圖11 Twist 在骨軟骨瘤中陽性表達 (× 400) Fig.11 Positive expressions of Twist in osteochondroma (× 400)

圖12 Twist 在骨軟骨瘤中陰性表達 (× 400) Fig.12 Negative expressions of Twist in osteochondroma (× 400)

三、Twist 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達情況

對本實驗中所有骨肉瘤患者均經(jīng)術(shù)后隨訪，失訪 8例，全為 Twist 表達陽性。其中轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組兩組 Twist 表達的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05) (表 4，圖 22)。

表4 Twist 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達情況Tab.4 Twist expressions of osteosarcoma metastatic group and nonmetastatic group

四、骨軟骨瘤、骨肉瘤中 E-cadherin 的表達

E-cadherin 在骨腫瘤細胞中陽性染色部位主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，胞膜僅少量有表達，為棕黃色，顯色過強時為棕褐色，可見細小顆粒 (圖 13～18)。

50例骨肉瘤組織與 12例骨軟骨瘤組織兩組E-cadherin 表達的陽性率和表達強度比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) (表 5，圖 19)。

五、骨肉瘤中 E-cadherin 表達與其病理分型和分級的關(guān)系

1. E-cadherin 表達與病理分型的關(guān)系：四組不同病理分型中 E-cadherin 表達陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05) (表 6，圖 20)。

2. E-cadherin 表達與病理分級的關(guān)系：低級別(I 級) 組與高級別 (II、III 級) 組中 E-cadherin 表達的陽性率和表達強度比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05) (表 7，圖 21)。

六、E-cadherin 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達情況

圖13 E-cadherin 在骨肉瘤中陽性表達 (× 100) Fig.13 Positive expressions of E-cadherin in osteosarcoma (× 100)

圖14 E-cadherin 在骨肉瘤中陽性表達 (× 400) Fig.14 Positive expressions of E-cadherin in osteosarcoma (× 400)

圖15 E-cadherin 在骨肉瘤中陰性表達 (× 400) Fig.15 Negative expressions of E-cadherin in osteosarcoma (× 400)

圖16 E-cadherin 在骨軟骨瘤中陽性表達 (× 100) Fig.16 Positive expressions of E-cadherin in osteochondroma (× 100)

圖17 E-cadherin 在骨軟骨瘤中陽性表達 (× 400) Fig.17 Positive expressions of E-cadherin in osteochondroma (× 400)

圖18 E-cadherin 在骨軟骨瘤中陰性表達 (× 400) Fig.18 Negative expressions of E-cadherin in osteochondroma (× 400)

表5 E-cadherin 在骨肉瘤和骨軟骨瘤組中的表達情況Tab.5 E-cadherin expressions of osteosarcoma and osteochondroma

表6 E-cadherin 在骨肉瘤不同病理組織類型的表達情況Tab.6 E-cadherin expressions in different osteosarcoma pathological tissues

表7 E-cadherin 在骨肉瘤低級 (I 級) 與高級 (II、III 級) 組的表達情況Tab.7 E-cadherin expressions of osteosarcoma (grade I; grade II, III)

表8 E-cadherin 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達情況Tab.9 E-cadherin expressions of osteosarcoma metastatic group and non-metastatic group

本研究過程中失訪的8例骨肉瘤組織有 2例E-cadherin 表達陽性，6例陰性。轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中 E-cadherin 表達的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) (表 8，圖 22)。

七、骨肉瘤中 Twist 和 E-cadherin 表達的相關(guān)性

運用非參數(shù)檢驗中的 Spearman 等級相關(guān)分析骨肉瘤組織中 Twist 和 E-cadherin 表達強度之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，Twist 和 E-cadherin 表達強度呈明顯負相關(guān)且差異有統(tǒng)計學意義 (rs＝-0.457，P＜0.05) (表 9)。

表9 Twist 和 E-cadherin 在骨肉瘤組織中表達的相關(guān)性Tab.9 Correlations between Twist and E-cadherin expressions in osteosarcoma tissues

討 論

骨肉瘤好發(fā)于青少年，惡性程度和致殘率極高。臨床上治療骨肉瘤常采用擴大切除或截肢術(shù)，而保肢術(shù)需要聯(lián)合復(fù)雜的修復(fù)重建手術(shù)，治療具有挑戰(zhàn)性。骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展也和其它腫瘤相似，也是一個由多基因參與、多通路調(diào)控的復(fù)雜過程。因此，臨床上尋求基因治療骨肉瘤迫在眉睫。

一、Twist 與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

Twist 是一個可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育細胞重建并賦予其遷移能力的保守轉(zhuǎn)錄因子。Twist 高表達可能促進細胞惡性變，是某些惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，特別是與 EMT 及惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

圖19 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的陽性率圖20 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤不同組織類型中的陽性率圖21 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤低級和高級組中的陽性率圖22 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移組中的陽性率Fig.19 Positive rates of Twist and E-cadherin in osteosarcoma and osteochondromaFig.20 Positive rates of Twist and E-cadherin in different osteosarcoma tissuesFig.21 Positive rates of Twist and E-cadherin in the lower and higher groups of osteosarcomaFig.22 Positive rates of Twist and E-cadherin in the metastatic and nonmetastatic groups of osteosarcoma

目前研究顯示，Twist 主要通過以下作用機制導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展：(1) Twist 可抑制凋亡程序而激活抗凋亡程序，增強細胞抗凋亡能力，并促進細胞發(fā)生 EMT[13]。有研究表明 Twist 的凋亡抑制作用也可通過多種通路抑制抑癌基因 p53 的正常表達和轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抑制細胞凋亡作用，進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。Twist 還可以誘導(dǎo)細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制分子 p21WAF1 / CIP1 的表達，增加 p21mRNA 表達水平，抑制細胞凋亡[14]。(2) Twist 參與調(diào)節(jié) Wnt 通路，導(dǎo)致細胞增殖、分化、凋亡及黏附等功能的改變。轉(zhuǎn)錄因子 Twist、APC、Axin 等可在多種人體腫瘤中發(fā)生突變，導(dǎo)致 Wnt 信號通路的紊亂，使其靶基因的相繼激活及細胞增生的失控，最終導(dǎo)致腫瘤細胞的形成[4]。(3) 大量研究顯示 EMT 參與了多種腫瘤脫離原發(fā)灶而發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程，Twist 作為EMT 過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)鍵作用[6]。Twist 與 Snail、SIP1 等其它調(diào)控因子一樣可抑制 E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄表達[15]，Twist 高表達的細胞中的 E-cadherin 和 β-catenin 等黏附蛋白表達降低，從而引起 EMT，其主要機制是 Twist 能與E-cadherin 啟動子區(qū)的 E-box 結(jié)合，抑制 E-cadherin mRNA 的轉(zhuǎn)錄，喪失細胞間黏附作用，從而促進EMT 發(fā)生[16]。另外，Twist 促進腫瘤浸潤侵襲轉(zhuǎn)移還表現(xiàn)在能促進腫瘤血管生成[17]。目前，在多種實體腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)，Twist 不僅參與了腫瘤的形成，還促進了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，惡性程度越高 Twist 表達也越高。

本研究顯示，Twist 在骨肉瘤組與骨軟骨瘤組表達陽性率比較和表達強度比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。這說明 Twist 在骨肉瘤中高表達，可能是通過抑制細胞凋亡和分化導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生；Twist 在骨肉瘤各種病理分型中陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)，說明 Twist 在其病理分型中表達無差別；隨著骨肉瘤惡性程度 (即分級指標) 的遞增，Twist 陽性表達率和表達強度均有上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，說明 Twist 陽性表達率和表達強度可作為判斷骨肉瘤分級及判斷預(yù)后的指標；在隨訪的轉(zhuǎn)移組中 Twist 陽性表達率為 93.10%(27 / 29)，非轉(zhuǎn)移組陽性率為 46.15% (6 / 13)，兩組差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，這提示 Twist 可能參與了骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

二、E-cadherin 與骨肉瘤的關(guān)系

E-cadherin 屬于上皮型鈣黏附蛋白，為 I 型跨膜糖蛋白，存在于幾乎所有上皮細胞和部分間質(zhì)細胞表面[18]，其主要生理功能有：(1) 介導(dǎo)細胞間連接，是保持細胞相互黏合的主要細胞黏附分子；(2)參與細胞分化和維持機體組織的結(jié)構(gòu)，必要時可通過改變細胞的微環(huán)境，影響細胞的分化，參與器官的形成與修復(fù)；(3) 維持原位功能，抑制細胞遷移，E-cadherin 表達減少或缺失使瘤細胞具有移動性，使原位腫瘤易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

大量研究表明，E-cadherin 在許多腫瘤組織低表達，而且惡性程度越高表達越低。E-cadherin 在正常細胞及大部分腫瘤細胞上主要為膜表達，胞質(zhì)內(nèi)少量表達。張海燕等[19]研究報道，E-cadherin 在胃癌組織中卻主要為細胞質(zhì)及核表達，包膜上極少表達，惡性程度越高其表達量越低。研究顯示，E-cadherin 存在或高表達的腫瘤其侵襲轉(zhuǎn)移能力較低，是一種腫瘤抑制蛋白，在乳腺癌[20]、肝癌[21]等許多腫瘤中已被發(fā)現(xiàn)。有實驗證實，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù) E-cadherin 可逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而阻斷 E-cadherin 在惡性腫瘤細胞內(nèi)的表達又可重新誘發(fā)侵襲轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與其它大部分腫瘤相比，E-cadherin 在骨腫瘤細胞中陽性染色部位主要定位細胞質(zhì)內(nèi)，胞膜僅少量有表達，其在骨肉瘤組和骨軟骨瘤組中陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。說明E-cadherin 的低表達與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程有一定的關(guān)系。

低級別 (I 級) 組與高級別 (II、III 級) 組中E-cadherin 表達的陽性率和表達強度比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。這說明 E-cadherin 與骨肉瘤惡性程度的關(guān)系不大，E-cadherin 尚不能作為評價骨肉瘤分級的指標。

E-cadherin 在骨肉瘤各種病理分型中陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)，說明 E-cadherin 在其病理分型中表達無差異；轉(zhuǎn)移組骨肉瘤與非轉(zhuǎn)移組骨肉瘤中 E-cadherin 表達的陽性率比較，非轉(zhuǎn)移組明顯高于轉(zhuǎn)移組 (P＜0.05)。這提示 E-cadherin 低表達也可能參與了骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

三、骨肉瘤中 Twist 與 E-cadherin 之間的關(guān)系

大量研究表明，Twist 與 E-cadherin 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起非常關(guān)鍵的作用，且分別通過多種通路導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前，在研究腫瘤中 Twist 與E-cadherin 關(guān)系的焦點通路為 EMT，Twist 可以與E-cadherin 啟動子區(qū)的 E-box 結(jié)合，抑制 E-cadherin mRNA 的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)由 E-cadherin 介導(dǎo)的細胞間黏附消失，并使上皮細胞發(fā)生 EMT 轉(zhuǎn)化。有研究報道，通過阻止骨肉瘤細胞 Wnt / LRP5 信號通路可明顯上調(diào) E-cadherin 表達，并且可明顯降低 Twist 介導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移能力[23]。但在骨肉瘤組織中 Twist 下調(diào) E-cadherin 表達的作用機制尚不明確，Twist 是否還存在另外的通路導(dǎo)致 EMT、促進瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。

本研究運用非參數(shù)檢驗中的 Spearman 等級相關(guān)分析骨肉瘤組織中 Twist 和 E-cadherin 表達強度之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，Twist 和 E-cadherin 表達強度之間呈明顯負相關(guān)且差異有統(tǒng)計學意義 (rs＝-0.457，P＜0.05)，這說明 Twist 在骨肉瘤中高表達可能抑制 E-cadherin 的表達，EMT 可能也參與了骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。國內(nèi)外絕大多數(shù)研究表明 EMT 主要是上皮性來源腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制，而在間葉源性的骨肉瘤中 Twist 與 E-cadherin 是否還通過另外的途徑導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移尚需進一步研究探討。