環(huán)狀RNA在心血管疾病臨床診斷和預警中的研究進展

呂夢偉, 章 興 綜述, 張楊楊，4 審校

(1. 南京醫(yī)科大學上海東方臨床醫(yī)學院，南京 210029； 2. 同濟大學心律失常教育部重點實驗室，上海 200120； 3. 南京醫(yī)科大學兒科學院，南京 211166； 4. 同濟大學附屬東方醫(yī)院心臟大血管外科，上海 200120)

人類基因組只有部分DNA用于編碼蛋白質(zhì)，其余大部分轉(zhuǎn)錄成各類RNA最終并不被翻譯成蛋白質(zhì)，這些RNA稱為非編碼RNA[1]。部分非編碼RNA參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、剪切和修飾等，在生命活動中發(fā)揮重要的作用。環(huán)狀RNA(circularRNA，circRNA)是一類雙鏈閉合非編碼RNA，無5′帽子結(jié)構(gòu)及3′poly A尾，長度在幾百到幾千個核苷酸不等，不受RNA外切酶降解，穩(wěn)定且廣泛地存在于真核生物，具有進化保守性[2]。circRNA在許多疾病中起著重要的調(diào)控作用，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、糖尿病和腫瘤等[3]。本文就circRNA在心血管疾病臨床診斷和預警方面的應用研究現(xiàn)狀進行綜述。

circRNA主要來自于外顯子，和一般的RNA剪接模式不同。這種結(jié)構(gòu)上的差異體現(xiàn)在3′端和5′端通過環(huán)化的方式結(jié)合在一起[4]。目前主要有3種環(huán)化的方式。(1) 內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化： 以內(nèi)含子區(qū)域的順式作用元件配對為基礎(chǔ)，外顯子于前體信使RNA(messenger RNA, mRNA)的側(cè)面相接，形成反義剪接[5]。(2) RNA結(jié)合蛋白(RNA bindingprotein, RBP)驅(qū)動的環(huán)化： RBP識別并且結(jié)合內(nèi)含子中的特定基序，通過RBP之間的二聚作用，外顯子兩端的剪接位點相互靠近，于前體mRNA的側(cè)邊成環(huán)[6-7]。(3) 套索驅(qū)動式環(huán)化： 分為兩種，一種是前體mRNA在剪接過程中去除內(nèi)含子，內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)，此類circRNA不包含外顯子；另一種是由于外顯子跳讀形成套索，此類circRNA包含外顯子[8-9]。circRNA廣泛表達于人體的各種細胞、外周血、唾液和其他體液中，在某些情況下其表達水平要比相關(guān)的線狀RNA高10倍以上[5]。circRNA在分裂緩慢的組織細胞中豐度很高(如神經(jīng)細胞或其他分化程度較高的細胞)，在分裂迅速的組織細胞中豐度較低(如癌細胞)[10-11]。由于沒有游離端而增加了自身穩(wěn)定性，且在多種體液中富集，circRNA成為非侵入性生物標志物的理想候選者。

1 circRNA的生物學功能

1.1 微小RNA(microRNA，miRNA)海綿作用

circRNA可以吸附并隔絕miRNA，阻止miRNA與mRNA的相互作用。如來源于CDR1基因的circCDR1AS，含有許多miRNA-7的結(jié)合位點，能夠抑制miRNA-7對靶基因的調(diào)控[12]。

1.2 蛋白質(zhì)支架作用

circRNA可以結(jié)合蛋白質(zhì)，調(diào)控其活性。如來源于MBNL1基因的circRNA，包含許多MBNL1的結(jié)合位點。當MBNL1蛋白含量過高時，其轉(zhuǎn)錄本含量降低，轉(zhuǎn)而生成更多circRNA來結(jié)合MBNL1蛋白[6]。

1.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

Hela細胞與H9細胞中有一類circRNA亞型，主要定位于細胞核，通過與小核蛋白顆粒U1相互作用調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ的活性，提高其親本基因的轉(zhuǎn)錄水平[8，13]。

1.4 競爭性抑制作用

由于線狀剪接與反義剪接的供體與受體相同，circRNA的產(chǎn)生是以犧牲線狀mRNA為代價的。如果蠅S2細胞中提高線狀mRNA的含量會導致circRNA的表達水平降低[6]。

1.5 蛋白質(zhì)合成模板

circRNA缺乏典型的5′帽子結(jié)構(gòu)及3′poly A尾，無法被翻譯。但序列中引入內(nèi)部核糖體進入位點可使蛋白質(zhì)翻譯起始不依賴于5′帽子結(jié)構(gòu)，circRNA也可以被翻譯成蛋白質(zhì)[14-16]。

2 circRNA與心肌梗死后心力衰竭

左室重構(gòu)和心功能障礙是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后常發(fā)生的并發(fā)癥，如何對其準確預測是一個臨床難題。Vausort等[17]通過檢測心肌梗死相關(guān)circRNA(myocardial infarction associatedcircular RNA, MICRA)，預測心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生率。定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription-polymerasechain re-action, qRT-PCR)檢測結(jié)果表明，AMI患者外周血液中的MICRA表達水平顯著低于健康志愿者。綜合多種變量建立AMI后左室功能衰竭的預測模型，引入MICRA可以改善其預測功能，其綜合判別改善指數(shù)[18](integrated discrimination improvement, IDI)為0.07。研究發(fā)現(xiàn)，左心室射血分數(shù)(ejection fraction, EF)≤40%的AMI患者，外周血液中的MICRA水平顯著低于EF>40%的AMI患者(P<0.001)[19]。有序回歸多變量分析提示，MICRA和AMI后心功能障礙有著密切關(guān)系，MICRA能夠預測AMI后的心力衰竭。精準醫(yī)學時代，準確預測患者AMI后心力衰竭的發(fā)生風險，可以提前干預，提高治療效果，有助于醫(yī)療資源的合理分配。

3 circRNA與術(shù)后心房顫動

心房顫動(atrial fibrillation, AF)是冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting, CABG)后最常見的并發(fā)癥之一。術(shù)后心房顫動(postoperative atrial fibrillation, PoAF)的發(fā)生率與發(fā)病率、死亡率以及總治療費用顯著相關(guān)[20]。為了預防PoAF，臨床上常進行藥物干預，考慮到藥物副作用，對高?；颊叩母深A更有意義。高齡是PoAF公認的危險因素，體質(zhì)量指數(shù)[21]、高血壓、糖尿病[22]、左心房增大等也是危險因素，但目前還沒有能夠被廣泛接受的預測PoAF的風險模型。Zhang等[23]應用高通量技術(shù)分析患者CABG手術(shù)前1周的血樣，通過對比PoAF與非PoAF患者的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)9種circRNA明顯表達差異。擴大樣本量(365例)應用qRT-PCR對這9種circRNA進行驗證，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_025016與PoAF強相關(guān)性。受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)分析顯示，hsa_circ_025016預測PoAF的靈敏度為73.5%，特異度為77.8%，曲線下面積(area under curve, AUC)為0.802，表明 hsa_circ_025016對PoAF有預測效能。Harling等[24]研究表明，外周血液中的miRNA-483-5p表達水平是預測PoAF的潛在生物標志物。與miRNA相比，circRNA由于缺乏游離端而對核糖核酸酶R具有抗性，不容易被降解，其作為PoAF診斷和預后的生物標志物具有更穩(wěn)定的優(yōu)勢[23]。

4 circRNA與冠心病

冠心病(coronary artery disease, CAD)是全球高發(fā)病率和高死亡率的心血管疾病，早期診斷CAD的意義重大。目前冠狀動脈造影術(shù)(coronary arteriography, CAG)是診斷CAD的金標準[25]，但這種方法是有創(chuàng)性檢查，費用較高，并不適用于低?；颊叩暮Y查。心電圖(electrocardiogram, ECG)作為無創(chuàng)性的檢查，其靈敏度和特異度均比較低，診斷效能不佳。Zhao等[26]通過高通量技術(shù)分析CAD患者和健康志愿者的外周血，發(fā)現(xiàn)5個差異最大的circRNA。進一步研究表明，其中hsa_circ_0124644的表達水平與CAD的嚴重程度相關(guān)，SYNTAX評分越高，hsa_circ_0124644的含量也越高。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0124644診斷CAD的靈敏度為0.861，特異度為0.626。引入CAD的相關(guān)危險因素，如吸煙、高血壓、糖尿病、低密度脂蛋白和總膽固醇，調(diào)整后的靈敏度為0.759，特異度為0.704。Li等[27]通過高通量技術(shù)研究CAD患者和健康志愿者的外周血，發(fā)現(xiàn)2036個差異表達的circRNA，選取其中差異最大的5個circRNA，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)其中hsa_circ_11806-28、hsa_circ_6510-1和hsa_circ_11783-2的差異有統(tǒng)計學意義，引入相關(guān)危險因素后通過Logistic回歸分析表明hsa_circ_11783-2與CAD具有相關(guān)性。Deng等[28]通過高通量技術(shù)比較AMI患者和健康志愿者外周血中的circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_081881表達水平差異最大?；虮倔w論(geneoncology, GO)分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_081881有7個miRNA-548位點，可以起到miRNA海綿吸附作用，抑制miRNA-548對血漿中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)γ蛋白表達的調(diào)控作用，使得PPAR γ表達增加，進而減少泡沫細胞的形成。因此hsa_circ_081881可以作為AMI診斷的潛在生物標志物。

5 circRNA與室間隔缺損

室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)是常見的先天性心臟病，是各種原因?qū)е率议g隔在胚胎時期發(fā)育不全，形成異常交通，在心室水平產(chǎn)生左向右分流。隨著對VSD研究的深入，非編碼RNA在心臟發(fā)育中起著重要的作用[29]。Liu等[30]收集6例流產(chǎn)胎兒(24～28周)，在胎兒期應用超聲診斷是否患有VSD，胎兒流產(chǎn)后解剖確認，將其分為VSD組和非VSD組(每組3例)。應用高通量技術(shù)，分析兩組心肌中circRNA表達的差異，發(fā)現(xiàn)6234個差異表達的circRNA。從20個表達差異最大的circRNA中隨機選擇5個circRNA并通過qRT-PCR進行驗證，其差異表達的趨勢與高通量技術(shù)的結(jié)果一致。綜合GO分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)差異circRNA含有許多miRNA-30c結(jié)合位點。上調(diào)的miRNA-30c被報道可通過相關(guān)信號通路影響胚胎發(fā)育和P19細胞的分化，影響增殖和凋亡的平衡[31]。circRNA可以作為miRNA-30c的海綿，參與心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。這些差異表達的circRNA具有篩查診斷VSD的潛在臨床應用價值。

6 circRNA與原發(fā)性高血壓

原發(fā)性高血壓(essential hypertension, EH)是最常見的一種發(fā)病率高、危害性大的心血管疾病。EH的危險因素有很多，目前比較明確的有年齡、性別、區(qū)域和社會經(jīng)濟狀態(tài)[32-33]，遺傳因素也是目前研究的熱點。Bao等[34]根據(jù)CircBase數(shù)據(jù)庫的生物信息學分析，提示hsa_circ_0037911和EH的發(fā)生、發(fā)展高度相關(guān)。通過檢測EH患者和健康志愿者外周血，證實hsa_circ_0037911表達水平在兩組中有顯著差異。Bao等還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0037911的表達水平與血肌酐的濃度有著顯著的正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0.294，P<0.0001)。Santhanam等[35]發(fā)現(xiàn)血肌酐和血壓有著緊密的關(guān)系，血壓隨著血肌酐升高而升高，血肌酐升高也是高血壓的危險因素之一。結(jié)合Santhanam等關(guān)于血壓和血肌酐的研究結(jié)果，推測hsa_circ_0037911可能通過血肌酐濃度影響血壓[34]。Liu等[36]收集EH組(n=5)和對照組(n=5)的血液標本，高通量分析發(fā)現(xiàn)287個異常表達的circRNA。選取其中表達上調(diào)的hsa_circ_0126991和表達下調(diào)的hsa_circ_0041000，在另外的EH患者(n=89)和健康志愿者(n=89)中擴大驗證，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0126991的表達水平顯著升高，而hsa_circ_0041000的差異無統(tǒng)計學意義。ROC曲線分析提示hsa_circ_0126991可以作為預測EH的生物標志物，靈敏度0.724，特異度為0.673。

7 circRNA與子癇前期

子癇前期(preeclampsia, PE)是妊娠期高血壓的一種，不僅影響孕婦全身多個器官，而且嚴重地影響胎兒的生長、發(fā)育，引起生長受限、早產(chǎn)甚至死亡[37]。Jiang等[38]通過高通量技術(shù)分析PE患者和健康志愿者的血樣，發(fā)現(xiàn)2178個差異表達的circRNA，進一步驗證發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001855和hsa_circ_0004904在PE患者中顯著升高。酶聯(lián)免疫測定懷孕相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A, PAPP-A)，發(fā)現(xiàn)PE組中PAPP-A表達水平比健康志愿者顯著升高[(65.78vs41.38) pg/mL,P<0.05]。單獨應用circRNA(AUC=0.621)或PAPP-A(AUC=0.728)預測PE效能不佳；聯(lián)合應用circRNA和PAPP-A建立預測模型，具有更好的預測效能(AUC=0.940)。Hu等[39]通過高通量技術(shù)分析胎盤組織，發(fā)現(xiàn)8553個差異表達的circRNA，其中hsa_circ_0036877在PE患者胎盤組織中的表達水平低于健康志愿者。進一步研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0036877在PE患者外周血中的表達水平顯著高于健康志愿者。hsa_circ_0036877預測PE(AUC=0.846)，其靈敏度和特異度分別為85.3%和72.7%。Zhang等[40]在另外的研究中發(fā)現(xiàn)hsa_circ_101222聯(lián)合應用血漿蛋白因子內(nèi)毒素診斷PE，具有更好的預測效能，其診斷的靈敏度為70.73%，特異度為80.49%，AUC=0.876。

8 展 望

circRNA是一類特殊的雙鏈閉合RNA，與線狀RNA相比，在生物體內(nèi)相對穩(wěn)定[41]。一些臨床研究提示circRNA在AMI后心力衰竭、PoAF、CAD、AMI、VSD、EH、PE等心血管疾病的診斷和預警中具有潛在臨床應用價值。當然這些研究還存在著一些不足之處： AMI后心力衰竭研究缺乏對MICRA診斷價值的評估，患者臨床基線資料不完整；PoAF研究沒有對hsa_circ_025016相關(guān)信號通路進行深入研究，其調(diào)節(jié)AF的潛在機制需要探索；CAD診斷方面研究是單中心研究，易受當?shù)丨h(huán)境和人文因素的影響；AMI方面研究沒有擴大樣本量驗證circRNA的診斷作用；circRNA與VSD的研究沒有證明circRNA可以直接調(diào)節(jié)心臟發(fā)育，也沒有發(fā)現(xiàn)對mRNA或miRNA的影響；預測EH研究中臨床樣本量太小，且沒有根據(jù)患者體質(zhì)量指數(shù)進行配對。更大樣本量、更多臨床中心的研究才能更加令人信服地證實circRNA在心血管疾病中的診斷預警作用，同時也需要更多的基礎(chǔ)研究以闡明circRNA在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的生物學作用。