敖慧娟，石嘉琛，阿依木古麗·阿不都熱依木，喬自林，楊 琨

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

MDCK細(xì)胞系由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel 母曲架犬的腎臟中分離并培育，通常是以貼壁方式生長的上皮樣細(xì)胞.由于其病毒感染效率高、增殖快，不易變異，且適應(yīng)于無血清的生長條件，MDCK細(xì)胞系被公認(rèn)是最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一[1-3].由于MDCK細(xì)胞本身具有較高的成瘤性，用其生產(chǎn)疫苗的安全性一直存在著爭議[4-5].近年來，喬自林等通過單細(xì)胞克隆培養(yǎng)和篩選,得到了數(shù)株低成瘤性的MDCK細(xì)胞株[6]，將其與實驗室已有的高成瘤性細(xì)胞株一并做高通量分析發(fā)現(xiàn)，某些經(jīng)典的腫瘤通路被靶基因激活，其中l(wèi)ncRNA MSTRG.1056.2直接調(diào)控ERBB3激活PI3K-Akt通路，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[7].為了保證疫苗的安全性，開發(fā)低成瘤性 MDCK 細(xì)胞系不僅可以減輕下游純化工藝的難度，還可以從根本上降低以其生產(chǎn)流感疫苗后的接種風(fēng)險.

FOXN2[8]蛋白被證實與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在某些類型的腫瘤中已經(jīng)觀察到FOXN2的異常表達(dá).當(dāng)FOXN2被下調(diào)時，在T細(xì)胞白血病中起抑癌作用，抑制肺癌的腫瘤發(fā)生和放射抗性，與放療或化學(xué)療法治療的成年成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的不良預(yù)后密切相關(guān).FOXN2的沉默可以抑制癌干細(xì)胞的間質(zhì)表型.異位表達(dá)FOXN2的表達(dá)顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并改變了EMT標(biāo)記物(如E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白)的表達(dá).此外，F(xiàn)OXN2可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)SLUG表達(dá)，并且FOXN2的表達(dá)與乳腺癌組織中SLUG的表達(dá)呈負(fù)相關(guān).這些結(jié)果表明，F(xiàn)OXN2可能是EMT進(jìn)展的重要因素，能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[9].檢測人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 A549 和人胚肺成纖維細(xì)胞 MRC-5中FOXN2的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)其在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平極顯著地低于 MRC-5細(xì)胞.在A549細(xì)胞中過表達(dá)FOXN2抑制了細(xì)胞的增殖，降低了細(xì)胞遷移侵襲能力[10].馬佳等人指出，F(xiàn)OXN2沉默可促進(jìn)肺癌中細(xì)胞周期的重新分布和腫瘤發(fā)生[11]，并發(fā)現(xiàn)泛素連接酶β-Trcp可通過作用FOXN2第365位和第369位絲氨酸使FOXN2泛素化降解，進(jìn)而抑制FOXN2的生物學(xué)效應(yīng)[12].

FOXN2作為一個抑癌基因，可以抑制肺癌A549細(xì)胞的生長增殖，可增強肺癌細(xì)胞的放療敏感性.但FOXN2對MDCK細(xì)胞成瘤性的影響尚不清楚，因此對不同成瘤性MDCK細(xì)胞中FOXN2差異表達(dá)及功能的研究具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 主要材料與器材

DMEM、MEM 、懸浮培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、0.25% 胰蛋白酶溶液(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司 )，新生牛血清、胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)，臺盼藍(lán)，T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶( Corning )，TRIzolTMReagent(Thermo)；EVOM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物公司)，All-in-OneTMqPCR Mix-實時熒光定量PCR檢測試劑盒(GeneCopoeia,Inc.).

倒置相差顯微鏡 CK-41 (日本 Olympus)，細(xì)胞計數(shù)儀 IC1000 (Countstar)，移液槍 20～200 μL、1 mL Easypet (eppendorf)，液氮罐 YDS-100-200F (樂山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 311 (Thermo)，普通冰箱(2～8 ℃) SC387 、超低溫冰箱(-80 ℃) DW-86L386(青島海爾股份有限公司)，臺式低速離心機(jī) TDL-80-2B (上海安亭科學(xué)儀器廠)，普通PCR擴(kuò)增儀CLASSC K960-Thmal Cycler(Heal force)，實時定量基因擴(kuò)增儀 CFX96TMReal-Time System(BIO-RAD).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

本實驗所選取的不同成瘤性細(xì)胞株是由課題組在前期實驗中馴化所得.前期裸鼠成瘤性實驗中發(fā)現(xiàn)：從ATCC引進(jìn)的貼壁型MDCK-A和由其馴化所得懸浮型MDCK-B在裸鼠成瘤性實驗中的成瘤率均高達(dá)100%(10/10).而將MDCK-A通過有限稀釋法制備得到的貼壁型單克隆細(xì)胞株MDCK-C的裸鼠成瘤率為10%(1/10).貼壁型MRC-5細(xì)胞由蘭州民海生物工程有限公司贈送，其裸鼠成瘤率為0(0/10).因此，選用MRC-5作為陰性對照.將本實驗室已有的不同成瘤性MDCK細(xì)胞從液氮罐中取出，置于37 ℃溫水中直至完全融化,將懸浮型MDCK-B用無血清培養(yǎng)基置于37 ℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上培養(yǎng),并將貼壁型細(xì)胞MDCK-A,MDCK-C,用含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，對照組MRC-5細(xì)胞含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基,置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 細(xì)胞總RNA的提取

棄掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，并吸去殘余的PBS.加入TRIzol試劑，用槍尖反復(fù)用力吸打裂解細(xì)胞，室溫放置5 min以徹底解離蛋白復(fù)合體.將細(xì)胞與裂解液分裝在2個1.5 mL的已滅菌的無RNA酶PE管中，加入氯仿使其與TRIzol的體積比為1︰5.用力上下?lián)u20 s，室溫靜置3～5 min，12000×g4℃離心10 min，并小心吸取上層水相到新的已滅菌的無RNA酶PE管中，加入100%異丙醇到水相中，使得異丙醇與TRIzol的體積比為1︰2.室溫放置8～10 min以沉淀RNA.12000×g4℃離心5 min后，小心棄上清，防止將RNA沉淀一并棄掉.同1 mL75%的無水乙醇漂洗RNA沉淀，即無水乙醇與TRIzol的體積比為1︰1.將無水乙醇中的RNA以7500×g4℃離心5 min.小心吸去無水乙醇，并打開EP管的蓋子，室溫干燥RNA沉淀5～8 min，注意不可完全干燥.用DEPC水30～50 μL溶解RNA沉淀，用槍尖反復(fù)吹打以徹底增加RNA溶解.吸取1～3 μL RNA測量所提RNA樣品A260/A280的OD值.

1.2.3 Real Time PCR

在做Real Time PCR 之前，需要將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.本實驗用的是艾科瑞生物公司的EVOM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒.

表1 去除gDNA試劑及反應(yīng)體系

將樣品混勻后進(jìn)行短暫離心，再將樣品放入PCR 儀中42 ℃ 2 min.取出樣品放置在冰上加入發(fā)轉(zhuǎn)錄試劑.

表2 反轉(zhuǎn)錄試劑及反應(yīng)體系

混勻后短暫離心，再將樣品放入PCR 儀中37 ℃15 min，85 ℃5 s.以上過程就是將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的全過程.將得到的cDNA保存于-20 ℃試劑中.利用Primer 5.0軟件根據(jù)目的基因FOXN2( GeneID: 3344)和內(nèi)參基因GAPDH(GeneID: 2597)設(shè)計所需要的引物，見表3.

表3 基因引物序列信息

將引物系列送到甘肅一棵樹生物有限公司合成后，再用GeneCopoeia,Inc.的All-in-OneTMqPCR Mix-實時熒光定量PCR檢測試劑盒對目的基因進(jìn)行檢測.其反應(yīng)體系見表4.

表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s;60 ℃退火20 s;72 ℃延伸15 s;95 ℃10 s到72 ℃15 s共40個循環(huán).溶解曲線分析為65 ℃10 s，95 ℃20 s.注意：每個樣品至少要做3個平行組.隨后搖勻，瞬時離心后，用BIO-RAD CFX96TMReal-Time System 分析目的基因在不同成瘤性MDCK 細(xì)胞中的表達(dá)量.2 h后可以根據(jù)反應(yīng)結(jié)果使用相對定量分析F=2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.其計算方法為ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=對照組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；最后2-ΔΔCt反映各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達(dá)水平.利用GraphPad Prism 5作圖分析目的基因的表達(dá)量并作差異性分析.

2 結(jié)果

2.1 不同成瘤性細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)48小時后置于顯微鏡下用4倍目鏡觀察細(xì)胞的生長狀況，如圖1所示.所培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞輪廓清晰，懸浮細(xì)胞的活力高、結(jié)團(tuán)少、均勻性好.其中MRC-5(圖A)成纖維狀生長；貼壁型MDCK-A(圖B)成上皮樣生長；懸浮型MDCK-B(圖C)呈圓形懸浮生長于無血清培養(yǎng)基中；MDCK-C(圖D)成上皮樣生長，可用于后續(xù)實驗.

A：陰性對照細(xì)胞MRC-5 B：貼壁型細(xì)胞MDCK-A C：懸浮型細(xì)胞MDCK-B D：單克隆貼壁型細(xì)胞MDCK-C

2.2 TRIzol Reagent 提取不同成瘤性細(xì)胞總RNA的純度分析

將提取的RNA進(jìn)行純度分析發(fā)現(xiàn)，所有樣品OD值均在1.8～2.0之間，可用于后續(xù)實驗,具體結(jié)果如表5所示.

表5 樣品純度檢測結(jié)果

2.3 不同成瘤性細(xì)胞中FOXN2基因表達(dá)量的分析

RT-PCR檢測結(jié)果顯示,所設(shè)計的引物特異性高，定量結(jié)果重復(fù)性好(圖2).以MRC-5為對照組，利用GraphPad Prism 5作圖分析目的基因的表達(dá)量并作差異性分析發(fā)現(xiàn)： FOXN2在和MDCK-C細(xì)胞中的 P value< 0.0001，差異極顯著(圖3)，且在高成瘤性MDCK-A、MDCK-B與低成瘤性MDCK-C細(xì)胞之間的表達(dá)存在差異(圖4).這說明FOXN2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量可能與細(xì)胞成瘤性成正相關(guān)，可為進(jìn)一步研究FOXN2在MDCK細(xì)胞成瘤性的作用機(jī)制提供理論參考.

圖2 引物特異性結(jié)果

圖3 FOXN2在不同成瘤性MDCK細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果

3 分析與討論

FOXN2被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān).在研究宮頸癌組織和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)lncRNA Wilms腫瘤1反義RNA(WT1-AS)顯著下調(diào).功能分析表明，WT1-AS的過表達(dá)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲.熒光素酶報告基因分析的結(jié)果證實，miR-203a-5p是WT1-AS的直接靶標(biāo).而FOXN2被鑒定為miR-203a-5p的直接靶基因[13].在接受化學(xué)療法或放射療法的患者中，TCGA驗證隊列中的低FOXN2 mRNA和不良結(jié)局相關(guān)[14].為了鑒定拷貝數(shù)突變靶向的新型癌癥相關(guān)基因，進(jìn)行T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)細(xì)胞系的基因組分析，識別了腫瘤抑制基因(TS)FBXO11和FOXN2.FBXO11，F(xiàn)OXN2和FOXN3的定量表達(dá)分析證實了已鑒定細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平的降低.生物信息學(xué)分析顯示，F(xiàn)OXN2和FOXN3與同源盒基因ZHX1同時減少.實驗證明，F(xiàn)OXN2和FOXN3都能直接激活ZHX1的轉(zhuǎn)錄[15].但FOXN2在MDCK細(xì)胞成瘤性的研究中少有報道.在本研究中，我們挑選了前期實驗室凍存的不同成瘤性細(xì)胞，旨在探究FOXN2在不同成瘤性細(xì)胞中的表達(dá)量關(guān)系，進(jìn)而為利用基因工程手段構(gòu)建穩(wěn)定的低成瘤細(xì)胞系奠定基礎(chǔ).結(jié)果表明，F(xiàn)OXN2在高成瘤性MDCK-A和MDCK-B與低成瘤性細(xì)胞株MDCK-C之間的表達(dá)量具有差異性(圖4).這由MDCK細(xì)胞群的多樣性擴(kuò)展到了其成瘤性蛋白表達(dá)的差異，并為進(jìn)一步開展FOXN2在MDCK細(xì)胞中的成瘤性機(jī)制研究提供了參考信息.

圖4 FOXN2在不同成瘤性 MDCK細(xì)胞中的差異表達(dá)

4 結(jié)論

本研究采用前期裸鼠成瘤性實驗中的不同成瘤性MDCK 細(xì)胞為研究原材料，結(jié)果表明FOXN2在高成瘤性MDCK細(xì)胞株MDCK-A和MDCK-B中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于低成瘤性細(xì)胞株MDCK-C.這由MDCK細(xì)胞群的多樣性擴(kuò)展到了其成瘤性蛋白表達(dá)的差異，并為進(jìn)一步開展FOXN2在MDCK細(xì)胞中的成瘤性機(jī)制的研究提供了參考信息.另外，本研究結(jié)果將來可用于表征不同MDCK細(xì)胞的克隆及馴化，為研究MDCK細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特征，以及評估MDCK細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)等提供基礎(chǔ).