土壤微生物對(duì)異噁草酮連續(xù)施用的響應(yīng)

張盈 吳小虎 李曉剛 段婷婷 徐軍 董豐收 劉新剛 鄭永權(quán)

（1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽 550006；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子（植物源）控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128）

異噁草酮、異惡唑啉酮類為選擇性苗前除草劑，因其具有除草譜廣、持效期長、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于防除大豆、水稻、甘蔗、油菜等田中的一年生雜草［1-2］。目前，我國已登記的異噁草酮產(chǎn)品50個(gè)，登記在大豆上的產(chǎn)品45個(gè)，是我國大豆田中除草劑使用較多的除草劑之一。然而，異噁草酮通常是土壤噴霧直接作用于土壤。而且，土壤中的異噁草酮降解緩慢，半衰期達(dá)10-137 d，殘存的異噁草酮刺激東北黑土中細(xì)菌和真菌的生長，抑制了多酚氧化酶活性［3］，對(duì)土壤微生物活性存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。

土壤微生物是非常敏感的組分，在土壤中發(fā)揮著重要的生態(tài)系統(tǒng)功能。土壤中微生物群落是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要指標(biāo)［4］，能夠通過改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)和功能等方式對(duì)環(huán)境變化作出響應(yīng)。目前，異噁草酮對(duì)于土壤微生物的影響大多數(shù)集中室內(nèi)培養(yǎng)條件下微生物種類、數(shù)量以及群落組成的影響［3，5-6］，如劉亞光等［3］研究結(jié)果表明異噁草酮（200 μg/kg、500 μg/kg和700 μg/kg）刺激東北黑土中細(xì)菌和真菌的生長，Tomco等［5］發(fā)現(xiàn)厭氧條件下異噁草酮降低了土壤中總PLFA含量，好氧條件下改變了放線菌的生長動(dòng)態(tài)，Du等［6］研究發(fā)現(xiàn)80 mg/kg異噁草酮顯著降低粉砂質(zhì)壤土和黑土中細(xì)菌α多樣性，改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)以及影響了NO3--N濃度、固氮菌（nifH）及氨氧化細(xì)菌（AOB）基因拷貝數(shù)。

隨著生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展，土壤微生物的相關(guān)研究由群落組成向微生物間的相互作用和功能轉(zhuǎn)變。微生物間的相互作用不僅決定微生物群落的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，而且深入影響群落功能執(zhí)行［7-8］。馬壘發(fā)現(xiàn)砂姜黑土區(qū)長期施用磷肥提高了真菌網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度，增強(qiáng)群落穩(wěn)定性，增加對(duì)外界環(huán)境變化的“抵抗力”［9］。Mendes等［10］網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)抗性菜豆增強(qiáng)根際土壤微生物種群間關(guān)聯(lián)程度，降低病原菌對(duì)根部的侵染成功率。Gu等［11］利用FAPROTAX（Functional Annotation of Prokaryotic Taxa）預(yù)測了施用有機(jī)肥和化學(xué)肥料的茶園土壤細(xì)菌元素循環(huán)功能差異。因此，本文研究了異噁草酮對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的影響，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建土壤中的微生物群落分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)以及對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測，解析異噁草酮脅迫下微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的微生物間的互作關(guān)系以及N循環(huán)功能菌群的響應(yīng)，為評(píng)價(jià)其對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境效應(yīng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥劑：異噁草酮原藥（96%），山東濰坊先達(dá)化工有限公司生產(chǎn)；作物：大豆（中黃13號(hào)）；土壤：河北省廊坊市安次區(qū)炊莊中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試驗(yàn)基地（N39°30'55"，E116°36'52"）2年未進(jìn)行任何農(nóng)事操作和施藥的0-15 cm表層土壤，去除植物殘?bào)w和石塊等雜質(zhì)、混勻，2 mm過篩備用；供試土壤特性：粉砂質(zhì)壤土，pH為8.3，有機(jī)質(zhì)含量13.7 g/kg，速效鉀含量134 mg/kg，有效磷含量41.5 mg/kg，和分別為3.61 mg/kg和60 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2017-2018年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的設(shè)施日光溫室內(nèi)（N 40°2’2”，E106°17’33”）進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)置2個(gè)處理：T1：1 200 g a.i./hm2，田間推薦劑量以及CK：空白對(duì)照，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。在長575 mm×寬390 mm×高250 mm的塑料箱中裝入35 kg 供試土壤后均勻播種15粒大豆，于苗后1-2片復(fù)葉期噴施異噁草酮。2017年和2018年各噴施1次。第2次噴藥后第7、15、30、60、90天采集土樣，一份用于測定異噁草酮?dú)埩袅?，一份用于提取DNA后進(jìn)行細(xì)菌、真菌擴(kuò)增子測序和qPCR絕對(duì)定量測定土壤細(xì)菌、真菌以及氮循環(huán)相關(guān)的功能菌群（固氮菌nifH、氨氧化細(xì)菌AOB和氨氧化古菌AOA）的拷貝數(shù)。

1.2.2 土壤中異噁草酮?dú)埩袅繖z測 參照Du等［6］報(bào) 道 的QuEChERS提 取、UPLC-MS/MS（TQD，Waters）檢測土壤中異噁草酮濃度。土壤樣品經(jīng)0.2%甲酸乙腈提取，離心后取上層清液過0.22 μm濾膜，超高效液相色譜分離，電噴霧電離、正離子掃描、三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜以多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行檢測，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法定量分析。異噁草酮定量離子對(duì)為240.2＞125.1m/z。添加回收濃度為：0.1 mg/kg、0.5 mg/kg和5 mg/kg，每個(gè)濃度重復(fù)5次。

1.2.3 DNA的提取和qPCR檢測 土壤總DNA采用FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒（mp biomedicals，Santa Ana，CA，USA）提取。每個(gè)樣本稱取0.5 g干重的鮮土，按照說明書操作提取DNA。以1.5%瓊脂凝膠電泳檢測DNA完整性，Nanodrop 2000測量其濃度和純度。

參照Du等［6］的方法中引物和擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR，RT-PCR）測定細(xì)菌、真菌、氮循環(huán)功能菌群（nifH、AOA和AOB）拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線用10倍稀釋質(zhì)粒制作，20 μL反應(yīng)體系由10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），7 μL水，1 μL 10 μmol/L正反向引物和1 μL土壤DNA樣本。擴(kuò)增效率為83.2-104.5，R2≥0.992 8。

1.2.4 細(xì)菌和真菌群落的擴(kuò)增子測序 用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增［12］，特異性引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）［13］對(duì)真菌ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化后的擴(kuò)增片段使用Illumina HiSeq 4000基因文庫在PE250的讀取長度下測序。相關(guān)測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，F(xiàn)LASH軟件進(jìn)行拼接，UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/）去除單序列和嵌合體后按照97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，16S比對(duì)Silva138/16S_bacteria數(shù)據(jù)庫，ITS對(duì)比unite8.0/its_fungi數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 雙指數(shù)動(dòng)力學(xué)模型Y=A×e（-k1×t）+B×e（-k2×t）（KinGUIIv2.1 巴斯夫作物有限公司）分析異噁草酮在土壤中的降解情況。處理組與對(duì)照組間細(xì)菌、真菌以及氮循環(huán)相關(guān)的功能菌群拷貝數(shù)采用SPSS 22.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析（P＜0.05，P＜0.01）。

細(xì)菌和真菌擴(kuò)增子測序結(jié)果去除線粒體和葉綠素序列后按最小樣本序列數(shù)抽平，使用mothur（version v.1.30.1）分析計(jì)算樣品的Alpha多樣性值（Shannon指數(shù)和heip指數(shù)）?；赼bund_jaccard算法、Canberra算法分別進(jìn)行細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）分析，ANOSIM分析計(jì)算R值和P值。

為評(píng)估CK和T1土壤中微生物的互做情況，基于16S 和ITS擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析（http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena/login.cgi），構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)并計(jì)算特征參數(shù)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由模塊內(nèi)連通度（Zi）、模塊間連通度（Pi）來進(jìn)行表述。通過外圍節(jié)點(diǎn)（Zi≤2.5，Pi≤0.62），模塊樞紐（Zi＞2.5，Pi≤0.62），聯(lián)絡(luò)者（Zi≤2.5，Pi＞0.62）、網(wǎng)絡(luò)樞紐（Zi＞2.5，Pi＞0.62）確定關(guān)鍵物種［14］。網(wǎng)絡(luò)圖用Cytoscape 3.7.1繪制。

FAPROTAX http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/PiCrust.html注釋細(xì)菌OTU的N循環(huán)功能［15］。

2 結(jié)果

2.1 異噁草酮在土壤中的消解動(dòng)態(tài)

由表1可知，異噁草酮在土壤中平均回收率為88%-102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%-5.5%，方法的準(zhǔn)確性和精密性均滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求［16］。根據(jù)SANTE/12628/2019以添加回收最低水平作為分析方法的定量限（LOQ），異噁草酮在土壤中的LOQ為0.1 mg/kg。

表1 異噁草酮在土壤中的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

異噁草酮噴施2次后在土壤中殘留消解動(dòng)態(tài)如表2所示。2次施藥后第1天平均殘留量為5.0 mg/kg，第30天消解率達(dá)到72.1%，第90天消解率達(dá)到90.7%。降解曲線符合雙指數(shù)動(dòng)力學(xué)模型：Y=4.7843×e-0.04721t+0.5989×e-0.0014t，半衰期為17.4 d。

2.2 異噁草酮對(duì)土壤中總細(xì)菌含量和Alpha多樣性的影響

施用異噁草酮對(duì)土壤總細(xì)菌16S rDNA拷貝數(shù)、shannon、heip指數(shù)的影響見圖1。第2次施藥后第15天，T1中細(xì)菌拷貝數(shù)（5.04×109/g干土）比CK細(xì)菌拷貝數(shù)（6.67×109/g干土）降低了24.4%（P＜0.05）；30-90 d，T1與CK差異不顯著（P＞0.05）（圖1-A）。

表2 異噁草酮在粉砂質(zhì)壤土中的殘留量測定

16S擴(kuò)增子測序結(jié)果經(jīng)過質(zhì)量控制后得到3 693 084 條高質(zhì)量有效序列（每個(gè)樣品47 553-97 541條），去除線粒體和葉綠素序列、按最小樣本序列數(shù)抽平后，每個(gè)樣本中獲得30 866條有效序列，測序結(jié)果覆蓋度≥96.03%，稀釋曲線呈現(xiàn)平滑狀態(tài)，表明測序結(jié)果良好。圖1-B-C所示，施藥后第15天，T1中細(xì)菌shannon指數(shù)和heip指數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05），第7、30、60、90天，T1和CK的細(xì)菌shannon指數(shù)和heip指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 異噁草酮對(duì)土壤總細(xì)菌含量和shannon、heip指數(shù)的影響

2.3 異噁草酮對(duì)土壤中總真菌含量和Alpha多樣性的影響

圖2-A所示，施藥后第15天和60天，與CK的真菌拷貝數(shù)（2.66×108/g干土和3.34×108/g干土）相比，T1中真菌拷貝數(shù)（1.49×108/g干土和1.31×108/g干土）分別降低了43.9%和60.8%（P＜0.05）。然而，第7、30、90天，T1和CK無明顯差異（P＞0.05）。

圖2 異噁草酮對(duì)土壤總真菌含量和shannon、heip指數(shù)的影響

ITS擴(kuò)增子測序結(jié)果經(jīng)過質(zhì)量控制后得到4 113 350條高質(zhì)量有效序列（每個(gè)樣品42 830-114 867條），按最小樣本序列數(shù)抽平后有41 531條有效序列，測序結(jié)果覆蓋度≥99.64%，稀釋曲線呈現(xiàn)平滑狀態(tài)。圖2-B-C所示，施藥后第15天和第90天，T1中真菌shannon指數(shù)和heip指數(shù)明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），其它采樣時(shí)間無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 異噁草酮對(duì)細(xì)菌和真菌群落組成及Beta多樣性的影響

CK和T1組土壤細(xì)菌主要由變形菌門（Proteobacteria），酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria），綠彎菌門（Chloroflexi），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）組成，在各個(gè)樣本中5種菌門的相對(duì)豐度之和是72.67%-82.64%。其余相對(duì)豐度大于1%的門有擬桿菌門（Bacteroidetes），Patescibacteria門，粘球菌門（Myxococcota），浮霉菌門（Planctomycetes），厚壁菌門（Firmicutes）（圖 3-A）。從門的水平上對(duì)不同處理土壤樣品中細(xì)菌群落的組成進(jìn)行相似性聚類分析，T1和CK之間存在一定的差異（圖 3-A）。進(jìn)一步運(yùn)用abund_jaccard算法基于OTU水平對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果顯示T1和CK的群落組成在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間都存在明顯差異（P= 0.004-0.008，R=0.6160-0.9600）（圖3-B-F）。

圖3 不同樣本中細(xì)菌門的相對(duì)豐度和基于OTU水平細(xì)菌群落PCoA圖

子囊菌門（Ascomycota）是真菌群落中的優(yōu)勢菌門（圖4-A），在CK和T1處理組中的平均相對(duì)豐度分別72.24%-93.63%。其余大于1%的門是擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）。子囊菌門、擔(dān)子菌門和被孢菌門的序列數(shù)之和占真菌總序列數(shù)的86.82%-99.66%。從門的水平上對(duì)樣本中真菌群落的組成進(jìn)行相似性聚類分析，除第7天外，第15-90天T1和CK之間存在差異。運(yùn)用Canberra算法基于OTU水平對(duì)細(xì)菌真菌群落進(jìn)行PCoA分析，發(fā)現(xiàn)T1和CK的群落組成在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間都有明顯的差異（P= 0.004-0.0110，R=0.416-0.720）（圖4-B-F）。

圖4 不同樣本中真菌門的相對(duì)豐度和基于OTU水平真菌群落PCoA圖

2.5 異噁草酮處理下土壤微生物群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

通過篩選并保留80%樣本中同時(shí)出現(xiàn)的OUT構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，具體見圖5-A和表3。表3可得，經(jīng)驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)的平均聚類系數(shù)和模塊性指數(shù)明顯高于相應(yīng)的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)，說明本研究構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)為小世界網(wǎng)絡(luò)［17］和模塊網(wǎng)絡(luò)［14］。T1中節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接數(shù)、平均度以及平均路徑長度高于CK，這些指標(biāo)的差異在一定程度暗示了噴施異噁草酮使土壤微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。

系統(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)按模塊團(tuán)體歸因布局，去除網(wǎng)絡(luò)中小于5個(gè)節(jié)點(diǎn)的模塊。如圖5-A 所示，CK有12個(gè)模塊，T1有13個(gè)模塊，且T1中真菌OUT節(jié)點(diǎn)消失。圖5-B顯示，大部分節(jié)點(diǎn)（＞97%）屬于外圍節(jié)點(diǎn)；CK和T1中均無網(wǎng)絡(luò)樞紐。CK和T1中模塊樞紐和聯(lián)絡(luò)者顯著改變。網(wǎng)絡(luò)中有12個(gè)模塊樞紐，其中CK中有5個(gè)（OTU4502、OTU3456、OTU3739、OTU3639和OTU3738）；T1中7個(gè)（OTU3540、OTU3423、OTU3461、OTU3717、OTU2896、OTU 3725和OTU3507）。OTU3372、OTU3422和OTU3456屬于CK網(wǎng)絡(luò)中的聯(lián)絡(luò)者，OTU3350、OTU3604、OTU3672和OTU3720屬 于T1網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)絡(luò)者。2種網(wǎng)絡(luò)中的模塊樞紐屬于真菌被孢霉門和細(xì)菌芽單胞菌門、酸桿菌門、放線菌門、變形菌門、綠彎菌門，聯(lián)絡(luò)者中是酸桿菌門、Patescibacteria門和變形菌門（表4）。

表3 T1和CK的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮匦?/p>

2.6 異噁草酮對(duì)土壤N轉(zhuǎn)化功能微生物的影響

異噁草酮處理對(duì)固氮菌nifH、AOA、AOB基因拷貝數(shù)的影響見圖6。nifH、AOA、AOB基因拷貝數(shù)為3.96×107-3.19×108、7.05×106-2.53×108和2.15×106-1.78×107/g干土。對(duì)于nifH，施藥后第15天，nifH基因拷貝數(shù)增加了20.3%（P＜0.05）；其它采樣時(shí)間，T1和CK無明顯差異（P＞0.05）。對(duì)于AOB，施藥后第60天，AOB基因拷貝數(shù)降低了45.2%，第90天增加了72.4%（P＜0.05）；7-30天無顯著差異（P＞0.05）。對(duì)于AOA，施藥后7-90天，T1與CK 間無顯著差異（P＞0.05）。

FAPROTAX功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，第7天增加了固氮族群微生物，第15天降低了硝酸鹽反硝化、亞硝酸鹽反硝化、氧化亞氮反硝化、反硝化、亞硝酸鹽呼吸，第30天降低了反硝化作用，第60天降低了硝酸鹽氨化、亞硝酸鹽氨化、氧化亞氮反硝化、反硝化、亞硝酸鹽呼吸，第90天降低了反硝化，增加了固氮、硝酸鹽呼吸、氮呼吸（圖7）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)溫室條件下，土壤中異噁草酮降解呈現(xiàn)先快后慢的趨勢，前30 d降解率高達(dá)72.1%，后期降解18.6%。前期降解速率快可能是由于異噁草酮添加土壤后，有一部分處于自由溶解態(tài)或被弱吸附狀態(tài)，作為微生物生長的碳源；隨后的緩慢降解階段可能是由于不同的吸附位點(diǎn)或隨著時(shí)間的推移吸附量增加所致［18］。其它研究，如氟磺胺草醚、氟樂靈等除草劑在土壤中的降解動(dòng)態(tài)也呈現(xiàn)同樣的趨勢［19-20］。

連續(xù)兩次施用異噁草酮后，第15天顯著抑制細(xì)菌含量，卻顯著增加其群落多樣性和均勻度，這表明不同的細(xì)菌種群對(duì)異噁草酮響應(yīng)不同。而且，CK組存在4 413種OTU，施藥后OTU增長至4706種，進(jìn)一步證明異噁草酮的處理，增加了某些細(xì)菌物種。其它培養(yǎng)時(shí)間，處理間細(xì)菌含量無顯著性變化。Du等［6］研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)培養(yǎng)條件下，0.8 mg/kg異噁草酮（推薦劑量）處理對(duì)土壤中細(xì)菌拷貝數(shù)和多樣性沒有顯著影響。這些結(jié)果表明異噁草酮推薦劑量下使用，對(duì)土壤總細(xì)菌僅存在短期影響。此外，施藥后第7天，真菌群落多樣性和均勻度顯著降低；第15-60天真菌含量呈現(xiàn)降低的趨勢；第90天，群落多樣性和均勻度再次降低。異噁草酮處理后，網(wǎng)絡(luò)中真菌OTU節(jié)點(diǎn)以及模塊樞紐消失，暗示了真菌對(duì)于異噁草酮更加敏感。其它研究也發(fā)現(xiàn)，其它化學(xué)農(nóng)藥如氟磺胺草醚和氯氰菊酯也導(dǎo)致真菌生物量減少，表明真菌對(duì)于某些農(nóng)藥的脅迫更敏感、更容易在脅迫下中毒［19，21］。

模塊樞紐和聯(lián)絡(luò)者被認(rèn)為是生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，CK與T1網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)完全不同，這表明異噁草酮脅迫下，土壤中形成了新的關(guān)鍵微生物種群，以維護(hù)微生物群落與功能的穩(wěn)定。異噁草酮脅迫下，酸桿菌門Blastocatellia綱菌群、新鞘氨醇桿菌Novosphingobium和Vicinamibacteraceae菌群，變形菌門根瘤菌目菌群成為新的模塊樞紐；變形菌門根瘤菌目Rhizobiales菌群、交替赤桿菌屬（Altererythrobacter）科菌群成為新的聯(lián)絡(luò)者。Blastocatellia綱菌群能適應(yīng)不同pH環(huán)境，具有降解復(fù)雜的碳化合物的能力［22］。新鞘氨醇桿菌是代謝上的多功能種群，一些文獻(xiàn)報(bào)道具有一定的生物修復(fù)能力，可降解克百威和萘［23-24］。Vicinamibacteraceae科的一些成員能降解復(fù)雜的有機(jī)化合物，還可能有幾丁質(zhì)的降解基因［25］。交替赤桿菌屬中一些種群能還原硝酸鹽［26］；根瘤菌目的一部分微生物能參與生物固氮。因此，這些新增的關(guān)鍵菌群可能在抵抗異噁草酮的壓力以及維持土壤固有的生態(tài)功能中起著重要的作用。

圖5 基于OTU和隨機(jī)矩陣?yán)碚摲治龅拇蠖雇寥牢⑸锵到y(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)

表4 不同處理中的關(guān)鍵OTUs

圖6 異噁草酮對(duì)土壤中氮轉(zhuǎn)化功能菌群含量的影響

圖7 FAPROTAX對(duì)空白組和異噁草酮處理組大豆土壤細(xì)菌群落功能的預(yù)測（P＜0.05*，P＜0.01**）

此外，異噁草酮處理后，第15天增加了固氮菌基因含量，第60天降低了AOB基因含量，與功能預(yù)測的結(jié)果一致。異噁草酮還顯著降低了硝酸鹽反硝化、亞硝酸鹽反硝化、氧化亞氮反硝化等，表明異噁草酮可能抑制了反硝化過程。一些文獻(xiàn)報(bào)道外源物質(zhì)的加入能抑制土壤的反硝化，如硅肥使用使水稻土壤的反硝化速率下降［27］，棉隆的使用降低了土壤中反硝化基因（napA、narG、nirK、nirS、qnorB）的拷貝數(shù)［28］。預(yù)測的這些細(xì)菌的潛在功能有助于明確異噁草酮對(duì)大豆土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)功能的影響。異噁草酮的使用影響了土壤N循環(huán)功能，從而干擾了土壤生態(tài)的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

研究顯示田間推薦劑量連續(xù)2次施用后，短暫降低了土壤細(xì)菌含量，且真菌敏感性高于細(xì)菌，微生物群落結(jié)構(gòu)顯著改變，微生物間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨向復(fù)雜，關(guān)鍵物種發(fā)生改變，土壤N循環(huán)中反硝化過程受到顯著影響。