魏晶晶 張浩然 王志鴿 王慧春

（青海師范大學生命科學學院 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧 810008）

羊肚菌（Morchella），隸屬子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae），是一種名貴食藥用真菌［1］，其營養(yǎng)豐富，具有多種抗病毒、抗腫瘤等作用的生理活性物質(zhì)，在食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有著廣闊的應用前景［2］。

實際上，羊肚菌也是典型的土生真菌［3］，其生長過程與土壤有著密切聯(lián)系。申時才等［4］發(fā)現(xiàn)人工種植羊肚菌不需要施用任何肥料，同時還能減少土壤中氮、磷、鉀流失，有利于土壤的有機含量，還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3-4年后，種植過羊肚菌的土壤其養(yǎng)分含量比沒有種植過羊肚菌的土壤高5-7倍。羊肚菌主要在冬季栽培，在栽培周期內(nèi)，植物根系和土壤動物幾乎處于休眠狀態(tài)，土壤內(nèi)細菌、真菌及放線菌數(shù)量較少，此時羊肚菌便成為土壤中的優(yōu)勢菌株，可能成為影響土壤養(yǎng)分構(gòu)成和土壤酶活性變化的主要因素［5-6］。土壤酶活性是土壤質(zhì)量的指標之一，能夠直接敏感的響應土壤環(huán)境的變化［7］。土壤酶活性的表現(xiàn)，在一定程度上反映了土壤所處的狀態(tài)，是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預警和敏感指標，是土壤綜合肥力特征的有效反映［8-9］。其中蔗糖酶和淀粉酶廣泛存在于土壤中，是測定土壤酶活性的關(guān)鍵酶。土壤蔗糖酶可將蔗糖催化水解成容易被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖，提高土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化；土壤淀粉酶可分解土壤中不溶解的淀粉組分，生成可溶單糖，增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)［10］。

由于羊肚菌子實體產(chǎn)量有限，很多學者就將研究對象轉(zhuǎn)為羊肚菌菌絲體及其發(fā)酵產(chǎn)物。季向陽等［11］對羊肚菌發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，確定了其液體發(fā)酵的最佳條件。王瑩等［12］對比分析菌絲體與子實體的化學成分，表明兩者在營養(yǎng)成分上差異不大，并對羊肚菌菌絲體進行了培養(yǎng)基配方和條件的研究，得到了最優(yōu)配比。羊肚菌菌絲體營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，同樣具有很高的開發(fā)利用價值［13］。因此，本實驗探究了羊肚菌菌絲體的加入對土壤蔗糖與淀粉酶活性的影響，以評判羊肚菌改良土壤的可行性，為開發(fā)利用羊肚菌菌肥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 尖頂羊肚菌（Morchella conica），采集于青?；ブ鄙搅謭?，分離獲得純菌種，保藏于青海師范大學微生物實驗室。

土樣采挖于青海師范大學校園內(nèi)，取無植被生長離地表10 cm處土樣，碾碎過40目篩，密封置于4℃冰箱保藏待用。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體活化培養(yǎng)基［14］：200 g馬鈴薯，15 g瓊脂粉，20 g葡萄糖，1.5 g硫酸鎂（MgSO4），3 g磷酸二氫鉀（KH2PO4），1 L蒸餾水。

液體培養(yǎng)基［14］：100 g馬鈴薯，30 g蔗糖，1 g蛋白胨，5 g酵母膏，0.5 g硫酸鎂（MgSO4），0.5 g磷酸二氫鉀（KH2PO4），1 L蒸餾水。

1.1.3 主要試劑與儀器 試劑：甲苯、葡萄糖、麥芽糖、2%淀粉、8%蔗糖溶液、3，5-二硝基水楊酸、pH 5.5磷酸緩沖液、pH 5.6乙酸-磷酸緩沖液。

儀器：SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（鄭州南北儀器設備有限公司）、HZQ-F160A型高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海精密儀器儀表有限公司）、LS-35HD型立式壓力蒸汽滅菌器（濟南來寶醫(yī)療器械有限公司）、UV-1100型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌菌絲體培養(yǎng)

1.2.1.1 菌種活化 將保存的菌種轉(zhuǎn)接至斜面固體活化培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)5 d。

1.2.1.2 液體培養(yǎng) 將2 mm3的菌塊接入液體培養(yǎng)基中靜置24 h，后置于26℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)6 d，抽濾分離，收集菌絲體。

1.2.2 單因素試驗 以100 g土樣為基準，探究菌土質(zhì)量比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25（g/g），處理溫度25、26、27、28和29℃，處理時間3、5、7、9和11 d，對土壤蔗糖酶和淀粉酶活性的影響，每個處理3次重復。

1.2.3 正交試驗 按照單因子試驗結(jié)果，選擇菌土質(zhì)量比、溫度、時間為考察因素設計三因素三水平L9（33）正交試驗（表1和表2）。

1.2.4 酶活性測定

1.2.4.1 標準曲線的測定 配成葡萄糖與麥芽糖標準溶液（1 mg/mL）［15］。在10 mL試管中各進行5個處理，分別加入葡萄糖標準溶液1、2、3、4和5 mL（或麥芽糖標準溶液2、3、4、5和6 mL），DNS試劑3 mL，沸水浴5 min，冷卻后定容［16］。用紫外分光光度計在508 nm波長下測各管吸光度。繪制吸光值-葡萄糖（或麥芽糖）濃度曲線（圖1和圖2）。

圖1 葡萄糖標準曲線

圖2 麥芽糖標準曲線

1.2.4.2 酶活性測定［9］以培養(yǎng)24 h，1 g風干土樣中所含葡萄糖（或麥芽糖）毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性（H1）計算公式為：H1=（a1-b1-c1）×4淀粉酶活性（H2）計算公式為：H2=（a2-b2-c2）×5其中，a為試驗組所得葡萄糖（或麥芽糖）毫克數(shù)；b為無機質(zhì)對照組得到的葡萄糖（或麥芽糖）毫克數(shù)；c為無土壤對照組得到的葡萄糖（或麥芽糖）毫克數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計分析 對試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行直觀分析，各項測定指標用Excel 2010與Spass軟件計算繪圖。

2 結(jié)果

2.1 蔗糖酶活性結(jié)果

2.1.1 處理條件的單因素試驗結(jié)果

2.1.1.1 菌土質(zhì)量比對蔗糖酶活性影響 以100 g土樣為基準，菌土質(zhì)量比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25（g/g），在25℃處理3 d后，得到菌土質(zhì)量比對蔗糖酶活性影響結(jié)果（圖3）。由圖3可知，當菌絲體添加量為10 g即菌土質(zhì)量比為1∶10時，蔗糖酶活性值最大（H1=8.785 mg/g）。

圖3 菌土質(zhì)量比對蔗糖酶活性影響

2.1.1.2 菌土處理溫度對蔗糖酶活性影響 以100 g土樣為基準，處理溫度分別為25、26、27、28和29℃，在菌土質(zhì)量比為1∶25條件下處理3 d后，得到處理溫度對蔗糖酶活性影響結(jié)果（圖4）。由圖4可知，在處理溫度為28℃時蔗糖酶活性值最大（H1=9.803 mg/g）。

2.1.1.3 菌土處理時間對蔗糖酶活性影響 以100 g土樣為基準，處理時間分別為3、5、7、9和11 d，在菌土質(zhì)量比為1∶25，25℃下得到處理時間對蔗糖酶活性影響結(jié)果（圖5）。由圖5可知，在處理時間為5 d時蔗糖酶活性值最大（H1=2.999 mg/g）。

圖4 處理溫度對蔗糖酶活性影響

圖5 處理時間對蔗糖酶活性影響

2.1.2 菌土處理的正交試驗優(yōu)化 設計L9（33）正交實驗見表1，優(yōu)化結(jié)果見表3。

表1 菌絲體對蔗糖酶活性影響正交因素水平

表2 菌絲體對淀粉酶活性影響正交因素水平

由表3直觀分析可知，各因素對試驗結(jié)果影響的主次順序是處理溫度＞處理時間＞菌土質(zhì)量比；優(yōu)化得到的菌土處理對土壤蔗糖酶活性影響方案為A1B2C1，即菌土質(zhì)量比為1∶5、處理溫度28℃、處理時間3 d。該處理組合不在正交表試驗組中，需對該組合進行驗證試驗，重復3組，均值16.529 mg/g，高于正交試驗值。并對表3試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗方差分析

經(jīng)方差分析結(jié)果表明，菌土質(zhì)量比、處理溫度、處理時間對結(jié)果的影響均不顯著。根據(jù)驗證試驗確定A1B2C1該組合為最優(yōu)組合。

2.2 淀粉酶活性結(jié)果

2.2.1 處理條件的單因素試驗結(jié)果

2.2.1.1 菌土質(zhì)量比對淀粉酶活性影響 以100 g土樣為基準，菌絲體添加量分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25（g/g），在25℃處理3 d后，得到菌絲體添加量對淀粉酶活性影響結(jié)果（圖6）。當菌絲體添加量為20 g菌土質(zhì)量比為1∶5時淀粉酶活性值最大（H2=7.849 mg/g）。

圖6 菌絲體添加量對淀粉酶活性影響

2.2.1.2 菌土處理溫度對淀粉酶活性影響 以100 g土樣為基準，處理溫度分別為25、26、27、28、29、30、31和32℃，在菌絲體添加量為1∶25條件下處理3 d后，得到處理溫度對淀粉酶活性影響結(jié)果（圖7）?？芍寥赖矸勖笇囟鹊淖兓^為敏感，則處理溫度為29℃時淀粉酶活性值最大（H2=15.470 mg/g）。

圖7 處理溫度對淀粉酶活性影響

2.2.1.3 菌土處理時間對淀粉酶活性影響 以100 g土樣為基準，處理時間分別為3、5、7、9和11 d，在菌絲體添加量為1∶25，25℃下得到處理時間對淀粉酶活性影響結(jié)果（圖8）。表明處理時間為5 d時淀粉酶活性值最大（H2=6.193 mg/g）。

2.2.2 菌土處理的正交試驗優(yōu)化 設計L9（33）正交實驗見表2，優(yōu)化結(jié)果見表5。

由表5直觀分析得，各因素對試驗結(jié)果影響的主次順序是處理時間＞菌絲體添加量＞處理溫度；優(yōu)化得到的菌土處理對淀粉酶活性各因素水平的組合是A1B1C3，即菌土質(zhì)量比為1∶5、處理溫度28℃、處理時間7 d。該處理組合不在正交表試驗組中，對該組合進行驗證試驗，重復3組，均值20.052 mg/g，高于正交試驗值。對表5試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表6。

圖8 處理時間對淀粉酶活性影響

表5 正交試驗結(jié)果

表6 正交試驗方差分析

經(jīng)方差分析結(jié)果表明，菌土質(zhì)量比、處理溫度、處理時間對結(jié)果的影響均不顯著。根據(jù)驗證試驗確定A1B1C3該組合為最優(yōu)組合。

3 討論

土壤酶種類繁多，不同土壤酶種類對各影響因素的響應不同［17］。本研究考察了菌土質(zhì)量比、處理溫度和處理時間對土壤淀粉酶與蔗糖酶活性的影響，并得到了菌土影響土壤酶活性的最佳條件。試驗中隨著菌土質(zhì)量比、處理溫度和時間的逐漸增大，土壤蔗糖酶與淀粉酶呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。其中，隨著處理溫度的逐漸升高，土壤蔗糖酶與淀粉酶活性較其它兩種因素對酶活性影響，變化幅度較大。原因可能是因為土壤酶活性對溫度較為敏感。已有研究發(fā)現(xiàn)，溫度是影響土壤酶活性的重要環(huán)境因子，對土壤酶活性有直接作用，一般情況下，土壤酶活性在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高而升高，到達最適溫度后土壤酶活性下降［18］，可能是由于增溫可以通過影響酶動力學性質(zhì)來影響土壤酶活性，還會通過影響土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)組成等間接地影響土壤酶活性［19］。另外，在菌土影響酶活性的最佳條件中，土壤淀粉酶與蔗糖酶活性的最佳溫度均為28℃，但李天星［20］的研究表明羊肚菌菌絲體在3-25℃均能生長，最適溫度18-22℃。兩者結(jié)果存在差異，可能是因為試驗過程中儀器顯示溫度與菌土實際溫度有誤差，或者受到菌土質(zhì)量比與時間因素的影響，還有待進一步研究分析。

試驗中隨處理時間的延長，兩種酶活性均表現(xiàn)為先升高后降低之后酶活性變化趨于穩(wěn)定。趙苗等［6］發(fā)現(xiàn)土壤蔗糖酶呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但土壤淀粉酶活性則表現(xiàn)先降低再升高后降低的變化趨勢與本試驗結(jié)果不同，可能是由于隨著時間的延長，羊肚菌菌絲體生物量急劇升高，羊肚菌開始將淀粉作為主要碳源之一，后酶活達到峰值，且開始降低。因此，土壤淀粉酶活性的變化趨勢還需試驗的長期監(jiān)控。試驗關(guān)于菌土質(zhì)量比對土壤酶活性的影響，所能參閱的相關(guān)資料較少，需繼續(xù)進行試驗探究。

在短期內(nèi)羊肚菌菌絲體的生長對土壤中蔗糖酶和淀粉酶活性均有提高。本試驗結(jié)果表明菌土質(zhì)量比、處理溫度、處理時間對土壤蔗糖酶和淀粉酶活性的影響均不顯著，究其原因可能是本試驗存在一定誤差且誤差自由度小，使得檢驗的靈敏度較低，從而掩蓋了考察因素的顯著性，需要在試驗過程中減小操縱誤差以及重復正交試驗次數(shù)的方法來改善試驗誤差。由于本試驗是在室內(nèi)條件下進行的，與野外試驗相比，雖有一定的可控性，但精確度存在差異，后續(xù)將增加野外實驗來進行深入研究。

此外，試驗期間還有菌渣產(chǎn)生，目前已經(jīng)有利用食用菌渣改良土壤的研究［21-23］，滕青等［24］將平菇菌渣加入到土壤的實驗中發(fā)現(xiàn)，施用菌渣可提高農(nóng)田土壤養(yǎng)分、有機質(zhì)含量、土壤酶活性和微生物數(shù)量，減少養(yǎng)分流失，改善農(nóng)田土壤生態(tài)環(huán)境。然而，有關(guān)羊肚菌菌渣的研究報道少之又少，其菌渣是否也對改良土壤具有一定影響，是否能夠提高羊肚菌產(chǎn)量，需要深入的探索。

4 結(jié)論

本實驗采用3，5-二硝基水楊酸比色法，得到各因素對土壤蔗糖酶活性影響的主次順序是處理溫度＞處理時間＞菌土質(zhì)量比，菌土影響蔗糖酶活性最佳條件為溫度28℃，時間3 d，菌絲體添加量為1∶5，蔗糖酶活性為16.529 mg/g，與對照組相比土壤蔗糖酶活性增加為對照組的12倍。各因素對土壤淀粉酶活性影響的主次順序是處理時間＞菌絲體添加量＞處理溫度，菌土影響淀粉酶活性的最佳條件為時間7 d，菌絲體添加量1∶5，溫度28℃，淀粉酶活性為20.052 mg/g，與對照組相比土壤蔗糖酶活性增加為對照組的18倍。