蔣成輝 曾巧英 王萌 潘陽(yáng)陽(yáng) 劉旭明 尚天甜

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的病原菌，可引起人和動(dòng)物化膿感染、肺炎、腸炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥及膿毒癥等［1-2］。近年來(lái)由于抗生素的濫用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌耐藥性產(chǎn)生，以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）最為常見(jiàn)，由此導(dǎo)致的疾病逐漸增多，治療效果越來(lái)越不顯著。因此，迫切需要尋找新的抗金黃色葡萄球菌的藥物靶點(diǎn)和策略來(lái)控制病原菌的感染。表面蛋白是革蘭氏陽(yáng)性菌的一種重要毒力因子，在細(xì)胞粘附、生物被膜形成、抵抗吞噬及入侵宿主細(xì)胞等方面發(fā)揮著重要的作用［3］。分選酶（srt）廣泛的存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中，它可將攜帶有LPXTG基序分選信號(hào)的表面蛋白錨定到細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖上。金黃色葡萄球菌分選酶A（srtA）是細(xì)菌將表面致病性蛋白錨定到細(xì)胞壁上的關(guān)鍵酶［4］。研究表明通過(guò)抑制金黃色葡萄球菌Newman菌株srtA基因可降低金黃色葡萄球菌對(duì)機(jī)體的感染能力［5］。因此srtA是一個(gè)有潛在應(yīng)用價(jià)值的藥物治療靶標(biāo)［6］。

CRISPR/Cas9（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）是一種編輯效率較高的新型基因組靶向修飾技術(shù)。該技術(shù)僅通過(guò)一段sgRNA來(lái)識(shí)別靶位點(diǎn)，利用Cas9蛋白進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（Double-strand breaks，DSBs），真核生物可通過(guò)非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)方式和同源重組方式（Homology-directed repair，HDR）進(jìn)行自我修復(fù)從而達(dá)到高效的基因編輯效果，目前應(yīng)用已趨于成熟。原核生物除變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)等少數(shù)菌外，大多數(shù)細(xì)菌中并沒(méi)有非同源重組修復(fù)機(jī)制，因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在原核生物中運(yùn)用并不廣泛［7-10］。但隨著研究者不斷地優(yōu)化，該系統(tǒng)在原核生物中也取得一定的進(jìn)步。目前，已經(jīng)在大腸桿菌［11］，枯草芽孢桿菌［12］、恥垢分枝桿菌［13］、肺炎雙球菌［14］、乳酸菌［15］、巴斯德梭菌［16］及放線菌［17］等細(xì)菌中成功的進(jìn)行了基因編輯，可實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)的突變、剪切、刪除、插入、替換及多個(gè)基因同時(shí)編輯等一系列編輯方式［18］。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失株，為srtA的深入研究和抗金黃色葡萄球菌新藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐，為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在原核生物基因敲除和篩選等方面提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株與質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠（20±2g）購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

菌株：金黃色葡萄球菌USA300-TCH1516菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金生物有限公司。金黃色葡萄球菌RN4220菌株（金黃色葡萄球菌RN4220菌株為NCTC8325菌株經(jīng)紫外線和化學(xué)等方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶缺陷型菌株，其基因型為mec、rsbU、agr陰性。RN4220菌株能夠接受來(lái)源于外部的其他物種的DNA質(zhì)粒，同時(shí)，可以將外源質(zhì)粒DNA進(jìn)行修飾，修飾后的質(zhì)粒可以被野生型金黃色葡萄球菌接受而不被降解）由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)孫寶林老師饋贈(zèng)。

質(zhì)粒：pCasSA質(zhì)粒（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌溫度敏感性質(zhì)粒）由上?？萍即髮W(xué)季泉江老師饋贈(zèng)。pLI50質(zhì)粒（金黃色葡萄球菌單拷貝整合質(zhì)粒）購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 Marker、DL15000 Marker、瓊脂糖、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。普通TaqDNA聚合酶、DL5000 Marker、T4DNA連接酶、PrimeSTAR HS（PREMIX）、QuickCutTMEcoR I、QuickCutTMBamH I購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司。BsaI、XhoI和XbaI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB（北京）有限公司。I型核酸染料、卡那霉素、氨芐霉素、氯霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。溶葡球菌酶購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

培養(yǎng)基：LB固體和LB液體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌，TSB液體培養(yǎng)基和TSA固體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 利用NCBI上公布的USA300-TCH1516基因組序列，使用在線軟件CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor在srtA基因的CDS區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)sgRNA分別為：sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3。使用軟件primer5.0和DNASTAR分別設(shè)計(jì)srtA基因左右同源臂擴(kuò)增引物srtA-L-F和srtA-L-R，srtA-R-F和srtA-R-R；缺失回補(bǔ)基因擴(kuò)增引物HBsrtA-F和HB-srtA-R；sgRNA檢測(cè)引物（位于sgRNA兩側(cè)）srtA-sgRNA-F和srtA-sgRNA-R；srtA基因缺失鑒定引物WJD-srtA-F和WJD-srtA-R，NJD-srtA-F和NJD-srtA-R。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

1.2.2 金黃色葡萄球菌RN4220和USA300菌株感受態(tài)細(xì)菌的制備 參照Z(yǔ)hao等［19］金黃色葡萄球菌感受態(tài)細(xì)胞制作方法。分別挑取金黃色葡萄球菌RN4220和USA300菌株單個(gè)菌落于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后按照1∶1 000的比例接種到100 mL的LB培養(yǎng)基中，220 r/min搖菌培養(yǎng)至OD600值為0.6為止。無(wú)菌條件下將培養(yǎng)的細(xì)菌移至冰冷的50 mL滅菌離心管中，冰浴10 min后，4℃，5 000 r/min離心10 min。棄上清，加入50 mL的冰冷的0.5 mol/L的蔗糖溶液冰浴15 min后，4℃，5 000 r/min離心10 min。重復(fù)上述步驟，依次用1/2，1/4體積的蔗糖溶液重懸，最后棄去上清，加入5 mL冰冷的0.5 mol/L的蔗糖溶液重懸，分裝于1.5 mL冰冷的無(wú)菌離心管中，每管100 μL，-80℃冷凍保存，備用。

1.2.3 pCasSA-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建 使用在線軟件設(shè)計(jì)3對(duì)sgRNA。即選取srtA基因的CDS區(qū)中某一NGG（N為任意堿基）序列前面20個(gè)堿基的DNA片段，定義為sgRNA上游序列（sgRNA-F），將這段序列反向互補(bǔ)，定義為sgRNA下游序列（sgRNA-R），并分別在sgRNA上下游序列5'端添加“AAAC”和“GAAA”即為限制性內(nèi)切酶BsaI酶切位點(diǎn)。對(duì)sgRNA上下游序列通過(guò)堿基配對(duì)原則退火形成雙鏈sgRNA序列，退火體系為：sgRNA上下游序列（100 μmol/L）各2 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃到25℃每30 s降低1℃，4℃放置8 h。

表1 引物序列

質(zhì)粒pCasSA為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌溫度敏感性質(zhì)粒，用于金黃色葡萄球菌的基因編輯（圖譜見(jiàn)圖1）。該質(zhì)?？梢岳肂saI位點(diǎn)插入sgRNA片段，靶向目標(biāo)基因，利用XhoI和XbaI位點(diǎn)插入目標(biāo)基因左右同源臂序列，進(jìn)行同源修復(fù)，進(jìn)而達(dá)到金黃色葡萄球菌基因敲除的目的。

圖1 pCasSA圖譜［20］

構(gòu)建pCasSA-sgRNA質(zhì)粒。使用限制性內(nèi)切酶BsaI對(duì)pCasSA質(zhì)粒上的BsaI位點(diǎn)進(jìn)行特異性酶切，酶切體系為：pCasSA 30 μL、BsaI 2 μL、10×NEBuffer 5 μL、ddH2O 13 μL。使用天根生化科技（北京）有限公司DNA純化回收試劑盒進(jìn)行酶切質(zhì)粒的純化回收。酶切回收的pCasSA質(zhì)粒與退火后的雙鏈sgRNA序列經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接3 h。連接體系為：T4DNA Ligase 1 μL、10×T4DNA Ligase buffer 2 μL、退火后的雙鏈sgRNA序列12 μL，酶切回收后的pCasSA質(zhì)粒1 μL、ddH2O 4 μL。連接產(chǎn)物經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10中。用50 mg/μL的卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，30℃增菌后用，用sgRNA上游序列（sgRNA1-F，sgRNA2-F，sgRNA3-F）和sgRNA檢測(cè)下游引物srtA-sgRNA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將獲得的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性pCasSA-sgRNA質(zhì)粒（pCasSAsgRNA1，pCasSA-sgRNA2，pCasSA-sgRNA3）送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用MegAlign軟件進(jìn)行分析比對(duì)。

1.2.4 pCasSA-sgRNA質(zhì)粒切割效率檢測(cè) 將pCasSA-sgRNA質(zhì)粒（pCasSA-sgRNA1，pCasSAsgRNA2，pCasSA-sgRNA3）電擊轉(zhuǎn)入缺陷型金黃色葡萄球菌RN4220菌株中修飾（電擊條件：21 kV/cm，100 Ω，25 μF），提取質(zhì)粒（提前使用溶葡球菌酶進(jìn)行破壁處理）并轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌USA300菌株中（電擊條件：21 kV/cm，100 Ω，25 μF），在TSA固體培養(yǎng)基上30℃倒置培養(yǎng)2 d后，觀察平板上菌落的形態(tài)及數(shù)量。

1.2.5 pCasSA-sgRNA-srtA缺失質(zhì)粒的構(gòu)建 以金黃色葡萄球菌USA300菌株基因組為模板，用引物srtA-L-F和srtA-L-R，srtA-R-F和srtA-R-R分 別 擴(kuò) 增srtA基因左右同源臂srtA-L和srtA-R序列，反應(yīng)體系為：PrimeSTAR HS 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。使用融合PCR，將純化回收后的srtA-L和srtA-R兩段序列融合，融合體系為：PrimeSTAR HS 25 μL，srtA-L、srtA-R序列各2 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，獲得srtA-L+R序列。融合后的srtA-L+R序列濃度較低，需要將srtAL+R序列進(jìn)行再擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：PrimeSTAR HS 12.5 μL，srtA-L-F、srtA-R-R引物各1 μL，融合后的srtA-L+R序列25 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 2.2 min，35個(gè)循環(huán)。使用限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI將純化后srtA-L+R序列和有切割效率的pCasSA-sgRNA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。純化回收，T4DNA連接酶過(guò)夜連接，連接體系為：T4DNA Ligase 1 μL、10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL、srtA-L+R 9 μL，酶切后的pCasSA-sgRNA質(zhì)粒1 μL、ddH2O 7 μL。連接產(chǎn)物通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10中，用50 mg/μL卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，30℃增菌后，用引物srtA-L-F和srtA-R-R進(jìn)行PCR檢測(cè)并測(cè)序，正確的質(zhì)粒命名為pCasSA-sgRNA-srtA。

1.2.6 金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失株的構(gòu)建及其鑒定 將pCasSA-sgRNA-srtA質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220菌株經(jīng)修飾后，轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌USA300菌株中，用15 mg/μL氯霉素TSA固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性菌落，編號(hào)為：1-10號(hào)。30℃增菌后，提取基因組，用 引 物WJD-srtA-F，WJD-srtA-R，進(jìn) 行PCR初 步篩選，擴(kuò)增體系為：PrimeSTAR HS 12.5 μL，WJDsrtA-F、WJD-srtA-R引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)。對(duì)于疑似敲除的菌株，經(jīng)測(cè)序檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)，使用引物NJD-srtA-F，NJD-srtA-R檢測(cè)srtA基因是否存在。擴(kuò)增體系為：PrimeSTAR HS 12.5 μL，NJD-srtA-F，NJD-srtA-R引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃5 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。

1.2.7 重組質(zhì)粒消除 為消除重組質(zhì)粒對(duì)金黃色葡萄球菌USA300的影響，需要消除質(zhì)粒pCasSAsgRNA-srtA。具體方法參照Chen等［20］質(zhì)粒消除方法。選擇一個(gè)金黃色葡萄球菌srtA基因缺失（ΔsrtAUSA300）菌落。30℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后按照1∶1 000的比例接種到5 mL的不含有抗生素TSB液體培養(yǎng)基中，42℃，220 r/min培養(yǎng)，直到培養(yǎng)菌液出現(xiàn)混濁。取適量菌液劃線于TSB固體平板上，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。從平板上隨機(jī)挑取幾個(gè)菌落，接種于新鮮液體培養(yǎng)基中，直到培養(yǎng)菌液出現(xiàn)混濁，取適量分別涂布于含有5 mg/μL氯霉素或不含氯霉素的TSA固體培養(yǎng)基平板上。如果菌落在不含抗生素的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，而在含有抗生素的培養(yǎng)基平板上不生長(zhǎng)，證實(shí)重組質(zhì)粒消除。

1.2.8 金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 將菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床220 r/min培養(yǎng)24 h后，按1∶1 000的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床220 r/min培養(yǎng)，每隔0.5 h測(cè)一次OD600，測(cè)定10次，最后根據(jù)OD600值繪制出細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.9 金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失對(duì)小鼠生存率的影響 挑取金黃色葡萄球菌單個(gè)菌落于新鮮的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。然后按照1∶1 000的比例轉(zhuǎn)接到100 mL的TSB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600值為2.0。使用PBS溶液稀釋洗滌3次，調(diào)整各菌株菌量至同一水平，并稀釋至2×108CFU/mL的細(xì)菌濃度。將小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組（生理鹽水）、野生型菌株組（WT USA300）和基因缺失菌株組（ΔsrtAUSA300），每組15只小鼠。除正常對(duì)照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，其余組別小鼠分別注射相應(yīng)的2×108CFU/mL濃度的菌液，接種劑量為：每20 g小鼠接種0.2 mL。分別于0-14 d每天觀察小鼠死亡情況，并繪制小鼠生存率曲線。

1.2.10 金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失對(duì)器官組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的影響 使用1×108CFU/mL濃度的菌液尾靜脈注射小鼠，接種劑量為：每20 g小鼠接種0.1 mL。選用感染1 d、3 d、5 d后的小鼠眼球采血，頸椎脫臼處死小鼠，取心臟、腎臟、肝臟和脾臟，進(jìn)行臟器菌落計(jì)數(shù)。具體方法如下：無(wú)菌條件下，取出小鼠心臟、腎臟、肝臟和脾臟稱其重量；向組織樣本中加入1 mL PBS溶液后，置于高通量組織研磨儀中充分研磨成勻漿液；將勻漿液10倍梯度稀釋后，取200 μL樣品稀釋液涂布于TSB培養(yǎng)平板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h。菌落數(shù)在30-300之間視為計(jì)數(shù)有效。計(jì)算器官組織內(nèi)的載菌量（logCFU/g），公式為：CFU/g=［3個(gè)平板的CFU的平均數(shù)×5×勻漿液體積（mL）×稀釋倍數(shù)］/組織重量（g）。

為了鑒定感染小鼠器官組織中的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌，需要對(duì)平板菌落進(jìn)行鑒定。具體方法如下：挑取單個(gè)菌落，增菌后，進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)提取基因組，使用引物23S rRNA-F/R進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物寄送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.11 金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失對(duì)小鼠腎臟組織病理變化的影響 選用步驟1.13中感染1 d后的小鼠，眼球采血，頸椎脫臼處死小鼠，取腎臟用10%的中性甲醛溶液固定7 d，參考陳福廣［5］方法進(jìn)行石蠟切片制作與HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察小鼠腎臟病理變化。

1.2.12 金黃色葡萄球菌USA300菌株srtA基因缺失回補(bǔ)株的構(gòu)建 以金黃色葡萄球菌USA300菌株基因組為模板，HB-srtA-F，HB-srtA-R為引物擴(kuò)增srtA基因及其啟動(dòng)子片段（HB-srtA基因），反應(yīng)體系為：PrimeSTAR HS 25 μL，HB-srtA-F、HB-srtA-R各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。待純化回收后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和BamH I將pLI50質(zhì)粒和HB-srtA進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：QuickCutTMEcoR I 2 μL，QuickCutTMBamH I 2 μL，QuickCut Green Buffer 5 μL，PLI50/回補(bǔ)基因srtA1 μg ddH2O補(bǔ)充至50 μL。30 min后純化回收，用T4連接酶過(guò)夜連接，熱激轉(zhuǎn)化至DH5α菌株，37℃增菌后提取質(zhì)粒，用雙酶切和測(cè)序分別檢測(cè)回補(bǔ)質(zhì)粒PLI50-srtA是否構(gòu)建成功，將構(gòu)建成功的回補(bǔ)質(zhì)粒經(jīng)修飾后轉(zhuǎn)入ΔsrtAUSA300中，構(gòu) 建ΔsrtAUSA300回 補(bǔ) 株（Δ∷srtAUSA300）?；匮a(bǔ)株構(gòu)建成功后，需進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證，檢測(cè)srtA基因缺失后其功能是否恢復(fù)。即觀察srtA基因回補(bǔ)后，菌株生長(zhǎng)狀況，感染后小鼠生存率、器官組織載菌量及腎臟病理組織學(xué)變化。

1.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GrphPad Prism7.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以Mean±SD表示。應(yīng)用SPSS17.0分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P＜0.05視為差異性顯著，P＜0.01視為差異性極顯著。

2 結(jié)果

2.1 pCasSA-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將退火后的雙鏈sgRNA序列與酶切后的pCasSA質(zhì)粒連接后，用sgRNA上游序列（sgRNA1-F，sgRNA2-F，sgRNA3-F）和sgRNA檢 測(cè) 引 物srtAsgRNA-R進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)結(jié)果如圖2-A所示。將驗(yàn)證的pCasSA-sgRNA質(zhì)粒送公司測(cè)序，如圖2-B所示，測(cè)序結(jié)果正確。證明pCasSA-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 pCasSA-sgRNA質(zhì)粒切割效率檢測(cè)

將修飾后的pCasSA-sgRNA質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌USA300菌株中，30℃培養(yǎng)2 d后觀察。與對(duì)照組pCasSA質(zhì)粒菌落（圖3-A）相比，存在pCasSA-sgRNA2質(zhì)粒的菌落在TSA固體平板上僅有幾個(gè)生長(zhǎng)（圖3-D），存在pCasSA-sgRNA1，pCasSAsgRNA3質(zhì)粒的菌落幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)平板（圖3-B，3-C）。這說(shuō)明pCasSA-sgRNA2具有較高的切割效率。選用pCasSA-sgRNA2質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 pCasSA-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

圖3 pCasSA-sgRNA質(zhì)粒切割效率檢測(cè)

2.3 pCasSA-srtA-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以金黃色葡萄球菌USA300菌株基因組為模板，分別擴(kuò)增獲得大小為1 116 bp和1 178 bp的srtA基因左右同源臂srtA-L和srtA-R序列，用融合PCR將srtA-L和srtA-R序列融合后獲得2 294 bp的srtA-L+R序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示與預(yù)期結(jié)果一致。（圖4-A）。將srtA-L+R序列構(gòu)建到pCasSA-sgRNA2質(zhì)粒中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI雙酶切驗(yàn)證，如圖4-B所 示，獲 得10 260 bp和2 294 bp的2條 特異性條帶，均與預(yù)期大小一致。對(duì)重組好的質(zhì)粒送測(cè)序鑒定，結(jié)果與原序列一致。證明pCasSA-srtAsgRNA2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 金黃色葡萄球USA300 srtA缺失株的構(gòu)建及鑒定

將修飾后的pCasSA-srtA-sgRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入U(xiǎn)SA300菌株中，30℃培養(yǎng)2 d，TSA平板長(zhǎng)出菌落后，隨機(jī)挑取10個(gè)單個(gè)菌落，30℃增菌后，提取基因組，用引物WJD-srtA-F，WJD-srtA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定srtA基因敲除情況，如圖5-A所示，srtA基因沒(méi)有被敲除修復(fù)的菌，PCR顯示為3 044 bp，反之出現(xiàn)2 424 bp大小的條帶。為了進(jìn)一步檢測(cè)srtA基因是否被敲除，用引物NJD-srtA-F，NJD-srtA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖5-B所示，srtA基因沒(méi)有被敲除的菌，PCR將會(huì)擴(kuò)增出556 bp大小的條帶，反之不能擴(kuò)增出條帶。如圖5-C所示，測(cè)序結(jié)果與PCR驗(yàn)證結(jié)果一致。證明ΔsrtAUSA300構(gòu)建成功。

圖4 pCasSA-srtA-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

2.5 重組質(zhì)粒消除

pCasSA-srtA-sgRNA2質(zhì)粒經(jīng)30℃，42℃，37℃培養(yǎng)后。由于pCasSA質(zhì)粒中含有溫度敏感的repF復(fù)制子，使得該質(zhì)粒在42℃下無(wú)法復(fù)制，從而在細(xì)菌中消除。如圖6所示，在含有氯霉素的TSA平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)（圖6-A），在不含有氯霉素的TSA平板長(zhǎng)出菌落（圖6-B），證明重組質(zhì)粒pCasSA-srtAsgRNA2被消除，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.6 金黃色葡萄球菌USA300菌株srtA基因缺失回補(bǔ)株的構(gòu)建

回補(bǔ)基因HB-srtA經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得大小為1 080 bp的條帶（圖7-A），與質(zhì)粒pLI50（5 505 bp）連接后獲得pLI50-srtA質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamH I雙酶切驗(yàn)證獲得5 505 bp和1 080 bp大小的2條特異性條帶（圖7-B）。pLI50-srtA質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確，證明pLI50-srtA質(zhì)粒構(gòu)建成功。將修飾后的pLI50-srtA回補(bǔ)質(zhì)粒導(dǎo)入ΔsrtAUSA300中，成功構(gòu)建了Δ∷srtAUSA300。

圖5 ΔsrtA USA300菌株的篩選及鑒定

圖6 質(zhì)粒消除鑒定

2.7 金黃色葡萄球菌USA300 srtA基因缺失對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

如圖8所示，srtA基因缺失后，前2 h細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，2 h后進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期初期。與WT USA300相比，ΔsrtAUSA300生長(zhǎng)狀態(tài)相似。srtA基因回補(bǔ)后，Δ∷srtAUSA300生長(zhǎng)與WT USA300生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，證明srtA基因缺失并不會(huì)影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。說(shuō)明該突變是一種非致死性突變。

圖7 HB-srtA基因PCR擴(kuò)增及pLI50-srtA質(zhì)粒鑒定

2.8 金黃色葡萄球菌USA300 srtA基因缺失對(duì)小鼠生存率的影響

圖8 WT USA300，ΔsrtA USA300和Δ∷srtA USA300生長(zhǎng)曲線

小鼠經(jīng)尾靜脈接種2×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌后，對(duì)小鼠的生存率進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9所示。WT USA300顯著的引起了小鼠的死亡。srtA缺失后小鼠無(wú)死亡。srtA基因回補(bǔ)后，感染小鼠與WT USA300組的小鼠死亡情況基本一致，證明srtA基因回補(bǔ)后其功能基本恢復(fù)。

圖9 srtA基因缺失對(duì)小鼠生存率的影響

2.9 金黃色葡萄球菌USA300 srtA基因缺失對(duì)器官組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的影響

分別對(duì)感染1 d、3 d、5 d后的小鼠器官組織進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)心臟、腎臟、肝臟和脾臟中的細(xì)菌數(shù)量。如圖10所示，與WT USA300組相比，ΔsrtAUSA300組在小鼠心臟中的細(xì)菌數(shù)量（圖10-A）顯著減少（P＜0.05），在小鼠腎臟中的細(xì)菌數(shù)量（圖10-B）極 顯 著 減 少（P＜0.01），但WT USA300組與ΔsrtAUSA300組小鼠在肝臟和脾臟內(nèi)細(xì)菌數(shù)量（圖10-C，10-D）無(wú)顯著性差異。srtA基因回補(bǔ)后，Δ∷srtAUSA300組小鼠載菌量基本恢復(fù)至野生型水平。如圖11所示，平板菌落經(jīng)革蘭氏染色，油鏡下觀察呈單個(gè)、短鏈、葡萄狀的藍(lán)紫色菌落（圖11-A）。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，核酸瓊脂糖凝膠電泳獲得大小為1 136 bp的條帶（圖11-B），公司測(cè)序，最終鑒定感染小鼠組織中的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

圖10 srtA基因缺失對(duì)小鼠器官內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的影響

2.10 金黃色葡萄球菌USA300 srtA基因缺失對(duì)小鼠腎臟病理變化的影響

圖11 細(xì)菌的分離與鑒定

光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理變化，結(jié)果如圖12所示，正常對(duì)照組（圖12-A），細(xì)胞排列規(guī)則，腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)完整。WT USA300組（圖12-C）腎小球變性、嚴(yán)重壞死，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔變小或消失。腎間質(zhì)充血、水腫，并可見(jiàn)較大面積的彌漫性出血。ΔsrtAUSA300組（圖12-B）腎小球體積增大，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、腫大，腎小球囊腔狹窄，并可見(jiàn)局灶性出血，整體病變明顯減輕。srtA基因回補(bǔ)后，菌株對(duì)小鼠腎臟損傷程度基本恢復(fù)至與WT USA300組同等水平（圖12-D）。

3 討論

隨著耐甲氧西林、耐萬(wàn)古霉素等金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)和抗生素不良反應(yīng)的增加，使得防治金黃色葡萄球菌感染的難度加大。因此尋求新型藥物靶標(biāo)和開(kāi)發(fā)治療金黃色葡萄球菌感染的新藥物，已成為眾人近年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。新型藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)離不開(kāi)基因組層面功能基因的篩選以及后續(xù)基因功能的驗(yàn)證。金黃色葡萄球菌中用于功能基因篩選的技術(shù)主要為轉(zhuǎn)座子插入突變的方法。這種方法篩選過(guò)程十分繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且轉(zhuǎn)座子插入位置的隨機(jī)性，使得該技術(shù)不能應(yīng)用于特定的基因群［21］。后續(xù)基因功能的驗(yàn)證也離不開(kāi)該基因缺失株的構(gòu)建。以往金黃色葡萄球菌用于構(gòu)建基因缺失株的方法主要為基于同源重組的方法。以pBT2、pMAD、pKOR1和pIMAY質(zhì)粒最為常見(jiàn)。但大多操作繁瑣，需要正向或者反向的篩選，效率較低。張曉靜［22］使用pBT2穿梭質(zhì)粒構(gòu)建OatA基因敲除株，挑取1 440個(gè)單克隆，僅獲得3個(gè)陽(yáng)性克隆，效率不足1%。限制了高效基因功能的研究。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新型基因編輯技術(shù)，可以精確、高效的對(duì)基因組進(jìn)行敲除或者修飾，可在短時(shí)間內(nèi)獲得基因敲除突變體，從而更好地完成基因功能的研究［23］。

圖12 srtA基因缺失對(duì)小鼠腎臟病理學(xué)變化的影響

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，本研究以pCasSA為載體，人工引入srtA基因左右同源臂，構(gòu)建了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失株。具有效率高，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。挑取的10個(gè)菌株中，獲得2個(gè)基因缺失株。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，sgRNA可以靶向目標(biāo)基因，Cas9蛋白可以對(duì)基因組進(jìn)行特異性切割，獲得DSBs，由于非同源重組末端修復(fù)的缺乏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。但金黃色葡萄球菌存在逃逸機(jī)制，僅有極少數(shù)菌不被切割存活了下來(lái)［24］。因此本研究根據(jù)平板上菌落的多少，篩選獲得可能有切割效率的sgRNA。在篩選srtA基因缺失株時(shí)，往往敲除質(zhì)粒中同源臂的存在可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，因此本研究設(shè)計(jì)srtA基因外部和內(nèi)部鑒定引物，外部鑒定引物WJD-srtA-F，WJD-srtA-R位于同源臂兩端，能消除質(zhì)粒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。內(nèi)部鑒定引物NJDsrtA-F，NJD-srtA-R位于srtA基因內(nèi)部，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。這樣可以直觀的通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶大小達(dá)到初步篩選的效果。為避免pCasSAsrtA-sgRNA質(zhì)粒存在對(duì)金黃色葡萄球菌的影響，本研究利用pCasSA質(zhì)粒在42℃不能復(fù)制的原理，進(jìn)行質(zhì)粒的消除。最終獲得不含有質(zhì)粒的srtA基因缺失株。經(jīng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定顯示srtA基因缺失不會(huì)影響金黃色葡萄球菌USA300菌株的生長(zhǎng)。因此，抑制srtA的活性不會(huì)對(duì)病原菌帶來(lái)生存壓力，可以有效的減少細(xì)菌耐藥性的發(fā)生，有利于金黃色葡萄球菌藥物抑制劑篩選，以彌補(bǔ)目前針對(duì)耐藥性菌株感染的抗生素治療不足［25］。

金黃色葡球菌USA300菌株屬于MRSA，具有很強(qiáng)的毒力和致病性。據(jù)報(bào)道，MRSA菌血癥的死亡率可高達(dá)80%［26］。MRSA主要以皮膚軟組織和呼吸道感染為主，屬于多位點(diǎn)序列ST8型，通常包含SCCmecIVa型元件、arcA基因、編碼殺白細(xì)胞素（PVL）基因的噬菌體ФSA2USA，精氨酸分解代謝移動(dòng)遺傳元件（Arginine catabolic mobile Bsaed element，ACME）和SpeG基因［27］。這些基因被認(rèn)為是USA300菌株得以生存和發(fā)揮毒力作用的重要因素。srtA作為金黃色葡萄球菌最重要的轉(zhuǎn)肽酶，負(fù)責(zé)將20多種表面毒力因子蛋白錨定到細(xì)菌的細(xì)胞壁上，抑制后細(xì)菌感染小鼠的毒力顯著降低。USA300菌株強(qiáng)的致病性與毒力是否與srtA基因相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。因此，本研究構(gòu)建了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300srtA基因缺失株，尾靜脈接種金黃色葡萄球菌，建立了小鼠菌血癥模型，探究USA300菌株srtA基因缺失對(duì)小鼠致病能力的影響。結(jié)果顯示，與WT USA300相比，ΔsrtAUSA300顯著降低了小鼠的死亡率。在小鼠接種1×108CFU/mL濃度的金黃色葡萄球菌1 d、3 d、5 d后，與WT USA300組小鼠相比，感染ΔsrtAUSA300小鼠心臟中的細(xì)菌數(shù)量顯著性減少，腎臟中的細(xì)菌數(shù)量極顯著性減少，而肝臟和脾臟中的細(xì)菌量未見(jiàn)明顯降低，這與張奇文等［28］構(gòu)建單增李斯特菌srtA基因缺失株后肝臟和脾臟中載菌量顯著降低有所不同，這可能與不同種屬細(xì)菌與機(jī)體的相互作用機(jī)制不同有關(guān)。光學(xué)顯微鏡下觀察感染1 d后的小鼠腎臟組織病理變化，發(fā)現(xiàn)與WT USA300組小鼠相比，ΔsrtAUSA300組小鼠腎臟組織病變明顯減輕，表明srtA基因的缺失降低了細(xì)菌對(duì)腎臟的損傷，這可能與srtA基因的缺失后減少了某些炎性因子的含量或參與調(diào)節(jié)炎癥的某種信號(hào)通路有關(guān)。此外，MRSA對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥，有研究表明生物膜形成與耐藥性產(chǎn)生有關(guān)［29］，而srtA錨定的多種表面蛋白參與細(xì)菌生物膜的黏附機(jī)制，是否srtA基因的缺失與細(xì)菌的耐藥性有直接或者間接的關(guān)系，需要進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果表明，srtA基因缺失并沒(méi)有使USA300菌株完全喪失對(duì)小鼠的致病性，可見(jiàn)srtA分選的表面蛋白只部分參與了細(xì)菌的致病力。盡管srtA參與了眾多C端含有分選信號(hào)的表面毒力蛋白錨定到細(xì)胞表面的過(guò)程，可能致病菌本身還存在其他作用機(jī)制或其他毒力因子作用，或存在類似蛋白分擔(dān)srtA的作用，srtA基因缺失后激活了相似蛋白發(fā)揮補(bǔ)償作用。這方面的研究需要進(jìn)一步去探索。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300菌株srtA基因缺失株和回補(bǔ)株，為深入研究耐甲氧西林金黃色葡萄球菌srtA基因提供實(shí)驗(yàn)菌株，為進(jìn)一步闡明金黃色葡萄球菌毒力因子的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。