趙公錦彭 麗方忠意吳寧鵬李金磊李 孟吳志明?

（1． 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002；2． 河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州450008）

大腸桿菌病是豬群中常見的細(xì)菌性疾病，是危害仔豬健康的重要傳染病之一。 目前防治該病的主要手段是使用抗菌藥物，但由于不規(guī)范或?yàn)E用抗菌藥物現(xiàn)象的存在，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。 動物源耐藥菌的大量出現(xiàn)與廣泛流行，不僅影響到畜禽養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，更嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。 氟苯尼考、頭孢噻呋、粘桿菌素是獸醫(yī)臨床治療大腸桿菌病的常用藥物。 大腸桿菌對氟苯尼考、頭孢噻呋、粘桿菌素的主要耐藥基因分別為floR、CTX－M、mcr－1，都是通過質(zhì)粒在細(xì)菌中間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移的耐藥基因［1－3］，對于傳播大腸桿菌耐藥性具有很大的風(fēng)險。 本研究對2013 －2018年河南省豬源大腸桿菌耐藥基因floR、CTX－M、mcr－1 的分布特征及流行規(guī)律進(jìn)行了調(diào)查，旨在了解河南省豬源大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀，進(jìn)一步探索認(rèn)識其分子流行規(guī)律，從而保障公共衛(wèi)生安全和生態(tài)環(huán)境安全。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 856 株樣本來自2013 －2018 年河南省鄭州、開封、焦作、許昌四個地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場健康豬的肛門拭子，由河南省獸藥飼料監(jiān)察所分離保存。 大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC 25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1．1．2 試劑耗材 營養(yǎng)瓊脂，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PCR 預(yù)混酶，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；離心管和96 孔PCR 反應(yīng)板，購自美國Axygen 公司；50 ×TAE、溴化乙錠（EB），購自索萊寶生物科技有限公司；瓊脂糖，購自西班牙BIO?WEST 公司。

1．1．3 儀器設(shè)備 PCR 擴(kuò)增儀，購自美國Applied Biosystems 公司；凝膠電泳儀和凝膠電泳成像系統(tǒng)，購自美國Bio－Rad 公司；恒溫培養(yǎng)箱，購自上海一恒科技有限公司；濁度儀，購自無錫市光明濁度儀廠；立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，購自日本三洋公司；生物安全柜，購自美國Thermo 公司；離心機(jī)，購自德國Sigma 公司；水浴鍋，購自金壇市醫(yī)療儀器廠；電冰箱，購自青島海爾股份有限公司；超低溫冰箱，購自美國Thermo 公司；純水儀，購自Milipore 公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)菌培養(yǎng) 將甘油保種凍存的856 株豬源大腸桿菌從冰箱中取出，放置室溫至融化。 在生物安全柜里，用一次性無菌接種環(huán)蘸取菌液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上。 恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h。

1．2．2 模板DNA 的制備 參照《分子克隆操作指南》，采用煮沸法提取細(xì)菌DNA 模板。 具體操作方法如下：上述培養(yǎng)的細(xì)菌4 ℃10000 r／min 離心5 min；棄上清，用200 μL 的TE 緩沖液將沉淀重懸；在100 ℃水浴中煮10 min 之后立即放置到0 ℃冰水混合物中冰浴10 min，然后4 ℃12000 r／min離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌EP 管中作為DNA 擴(kuò)增模板，置－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 耐藥基因的檢測 按照李孟等［4］建立的同時檢測floR、CTX－M、mcr－1 三種耐藥基因的多重PCR 檢測方法，對1．2．2 制備的DNA 模板進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為1．5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。 用凝膠成像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析。

1．2．4 藥敏試驗(yàn) 對856 株豬源大腸桿菌使用藥敏檢測板檢測菌群對氟苯尼考、頭孢噻呋、粘桿菌素的臨床耐藥性，統(tǒng)計(jì)耐藥情況。

2 結(jié)果與分析

2．1 豬源大腸桿菌耐藥基因floR、CTX－M、mcr－1的檢測結(jié)果 856 株豬源大腸桿菌中floR基因檢出率為67． 9% （581／856），CTX－M基因檢出率為8．4% （72／856），mcr－ 1 基 因檢出率為27． 6%（236／856）。 856 株豬源大腸桿菌中有222 株同時檢出兩種耐藥基因，檢出率為25．9%，其中153 株同時檢出mcr－1 基因和floR基因，檢出率17．9%（153／856），69 株同時檢出floR基因和CTX－M基因，檢出率為8．1%（69／856），沒有菌株同時檢出CTX－M基因和mcr－1 基因。 30 株豬源大腸桿菌中同時檢出三種耐藥基因，檢出率3．5%。 部分豬源大腸桿菌的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

圖1 部分樣品PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 1 Electrophoresis of amplified products PCR part of samples

2．2 不同年份豬源大腸桿菌耐藥基因floR、CTX－M、mcr－1 的檢測結(jié)果 以大腸桿菌分離年份統(tǒng)計(jì)，2013 －2018 年floR、CTX－M、mcr－1 基因的檢出率見圖2。 結(jié)果顯示，floR基因的檢出率最低為2014 年的56．1%、最高為2015 年的79．1%，2013 －2018 年平均檢出率為69．7%；CTX－M基因的檢出率最低為2013 年的2．6%，之后持續(xù)增長至2018 年的18%，平均檢出率9．6%；mcr－1 基因的檢出率在2014 年達(dá)到最高44．4%，2018 年檢出率下降為零，平均檢出率為24．3%。

圖2 2013－2018 年floR、CTX－M、mcr－1 耐藥基因檢出率Fig 2 The detection rates offloR，CTX－M， andmcr－1 resistance genes

2．3 不同地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥基因floR、CTX－M、mcr－1 檢測結(jié)果 以大腸桿菌來源地統(tǒng)計(jì)，鄭州、開封、焦作、許昌地區(qū)floR、CTX－M、mcr－1 基因檢出率結(jié)果見圖3。

圖3 鄭州、開封、焦作、許昌floR、CTX?M、mcr?1 基因檢出率Fig 3 Graphic representation of Zhengzhou，Kaifeng，Jiaozuo，XuchangfloR，CTX?M，mcr?1 gene detection rates

結(jié)果表明，在鄭州地區(qū)floR、CTX－M、mcr－1基因的檢出率分別為72．3%、2．1%、10．2%，在開封地區(qū)的檢出率分別為84．9%、16．5%、46．5%，在焦作地區(qū)的檢出率分別為48．5%、6．3%、7．2%，在許昌地區(qū)檢出率分別為82．3%、15．7%、43．8%。四個地區(qū)耐藥基因檢出率由高到低均為floR＞mcr－1 ＞CTX－M。

2．3．1 2013 －2018 年不同地區(qū)floR基因檢出率

2013 －2018 年，鄭州、開封、焦作、許昌地區(qū)大腸桿菌floR基因檢出率見圖4。 結(jié)果顯示，2013 －2018年，鄭州地區(qū)floR基因檢出率最低為2013 年的42．9%，最高為2017 年的90．0%，平均檢出率為72．3%；開封地區(qū)floR基因檢出率最低為2013 年的60．0%，最高為2018 年的95．0%，平均檢出率為84．9%；焦作地區(qū)floR基因檢出率最低為2014年的33．9%，最高為2016 年的60．0%，平均檢出率為48．5%；許昌地區(qū)floR基因檢出率最低為2014年的69．4%，最高為2015 年的100%，平均檢出率為82．2%。 可以看出，焦作地區(qū)floR基因歷年檢出率均未超過60． 0%，明顯低于其他三個地區(qū)，除2013 年外，其他年份的檢出率均為4 個地區(qū)最低。

圖4 2013－2018 年鄭州、開封、焦作、許昌floR基因檢出率Fig 4 The detection rate offloRgenes in Zhengzhou，Kaifeng， Jiaozuo， and Xuchang

2．3．2 2013－2018 年不同地區(qū)CTX－M基因檢出率2013 －2018 年，鄭州、開封、焦作、許昌大腸桿菌CTX－M基因檢出率見圖5。 鄭州地區(qū)CTX－M基因檢出率2015 年和2018 年均為0，最高為2017 年的5．0%，平均檢出率為2．1%；開封地區(qū)CTX－M基因檢出率2014 年為0，最高為2016 年的38．5%，平均檢出率為16．5%；焦作地區(qū)CTX－M基因檢出率2013 年和2015 年為0，最高為2018 年的15．0%，平均檢出率為6．3%；許昌地區(qū)CTX－M基因檢出率最低為2017 年的3．8%，最高為2018 年的45．0%，平均檢出率為15．6%。

圖5 2013－2018 年鄭州、開封、焦作、許昌CTX?M基因檢出率Fig 5 The detection rate ofCTX?Mgene in Zhengzhou，Kaifeng， Jiaozuo， and Xuchang

2．3．3 2013 －2018 年不同地區(qū)mcr－1 基因檢出率2013 －2018 年，鄭州、開封、焦作、許昌大腸桿菌mcr－1 基因檢出率見圖6。

圖6 2013－2018 年鄭州、開封、焦作、許昌mcr?1 基因檢出率Fig 6 The detection rate ofmcr?1 gene in Zhengzhou，Kaifeng， Jiaozuo， and Xuchang

結(jié)果顯示：4 個地區(qū)mcr－ 1 基因檢出率從2016 年開始呈下降趨勢，并在2018 年均降為0；鄭州地區(qū)檢出率最高為2014 年的22．9%，2017 年檢出率下降為0，平均檢出率為10．2%；開封地區(qū)檢出率最高為2014 年的88．0%，2018 年檢出率下降為0，平均檢出率為46．5%；焦作地區(qū)檢出率最高為2015 年的20．0%，2017 年檢出率下降為0，平均檢出率為7．2%；許昌地區(qū)檢出率最高為2014 年的85．7%，2017 年檢出率下降為0，平均檢出率為43．8%。

2．4 耐藥基因與耐藥表型相關(guān)性分析 對856 株豬源大腸桿菌進(jìn)行藥敏檢測，結(jié)果顯示：683 株大腸桿菌對氟苯尼考耐藥，耐藥率為79．8%，耐藥菌株中有581 株攜帶floR基因，攜帶率為85．1%；133株大腸桿菌對頭孢噻呋耐藥，耐藥率為15．5%，耐藥菌株中有72 株攜帶CTX－M基因，攜帶率為54．1%；266 株大腸桿菌對粘桿菌素耐藥，耐藥率為31．1%，耐藥菌株中有236 株檢出mcr－1 基因，攜帶率為88．7%。

2．4．1floR基因檢出率和氟苯尼考耐藥率比較

2013 －2018 年，豬源大腸桿菌中floR基因檢出率和氟苯尼考耐藥率比較見圖7。 數(shù)據(jù)顯示，2013 －2018 年，分離菌株氟苯尼考耐藥率最高為2015 年的93．8%，最低為2014 年的59．6%，平均耐藥率為81．3%，floR基因檢出率與其氟苯尼考的耐藥率呈正相關(guān)。

圖7 floR基因檢出率和氟苯尼考耐藥率比較圖Fig 7 Comparison offloRgene detection rate and florfenicol resistance rate

2．4．2CTX－M基因檢出率和頭孢噻呋耐藥率比較2013 －2018 年，豬源大腸桿菌中CTX－M基因檢出率和頭孢噻呋耐藥率比較見圖8。 數(shù)據(jù)顯示，2013 －2018年，分離菌株頭孢噻呋耐藥率最高為2017 年的48．9%，最低為2013 年的3．6%，平均耐藥率為19．0%，CTX－M基因檢出率與其頭孢噻呋的耐藥率基本呈正相關(guān)。

圖8 CTX－M基因檢出率和頭孢噻呋耐藥率比較圖Fig 8 Comparison ofCTX－Mgene detection rate and ceftiofur resistance rate

2．4．3mcr－1 基因檢出率和粘桿菌素耐藥率比較2013 －2018 年，豬源大腸桿菌中mcr－1 基因檢出率和粘桿菌素耐藥率比較見圖9。 數(shù)據(jù)顯示，2013 －2018年，分離菌株粘桿菌素耐藥率最高為2015 年的55%，最低為2018 年的0，平均耐藥率為27．9%，mcr－1 基因檢出率與其粘桿菌素的耐藥率呈正相關(guān)。

圖9 mcr－1 基因檢出率與多粘菌素耐藥率比較圖Fig 9 Comparison of detection rate of mcr－1 gene and polymyxin resistance rate

3 討論與結(jié)論

調(diào)查顯示，856 株豬源大腸桿菌中floR基因檢出率為67． 9%，CTX－M基因檢出率為8． 4%，mcr－1基因檢出率為27．6%，其中，floR基因檢出率最高，并且2013 －2018 年檢出率居高不下，李穎穎［5］的研究表明floR基因已經(jīng)成為傳播介導(dǎo)大腸桿菌耐藥的主要基因，說明河南省內(nèi)的豬源大腸桿菌對氟苯尼考耐藥性已經(jīng)達(dá)到較嚴(yán)重程度；CTX－M基因的檢出率低于李進(jìn)福［6］的研究結(jié)果（25．81%），但2013 － 2018 年檢出率逐年增高；2013 －2015 年河南地區(qū)mcr－1 基因的檢出率呈上升趨勢，與李振斌［7］研究結(jié)果一致，但從2016 年開始檢出率大幅下降，直至2018 年下降為0，這可能與我國在2016 年農(nóng)業(yè)部第2428 號公告中規(guī)定停止硫酸黏菌素用于動物促生長政策有關(guān)。

不同地區(qū)耐藥基因的流行趨勢也有一定差異，焦作地區(qū)floR基因平均檢出率明顯低于其他地區(qū)；相對于整體水平的持續(xù)增長，鄭州地區(qū)CTX－M基因檢出率一直穩(wěn)定在較低水平；開封和許昌地區(qū)mcr－1 基因檢出率明顯高于鄭州和焦作，這些差異可能與各地用藥習(xí)慣不同有關(guān)。

通過統(tǒng)計(jì)floR、CTX－M、mcr－1 基因在其耐藥菌中的攜帶率，發(fā)現(xiàn)floR基因在氟苯尼考耐藥菌株中的攜帶率為85．1%，低于郭樹源等［8］2015 年對山東地區(qū)耐氟苯尼考菌株floR基因攜帶率的研究結(jié)果（100%）；CTX－M基因在頭孢噻呋耐藥菌中的攜帶率為54．1%，與楊守深等［9］2018 年在福建地區(qū)分離的頭孢噻呋耐藥菌株中CTX－M基因攜帶率50．1%的結(jié)果相近；mcr－1 基因在粘桿菌素耐藥菌中攜帶率較高（88．7%），導(dǎo)致mcr－1 流行的主要原因在于質(zhì)粒介導(dǎo)的傳播方式［10］。

本研究調(diào)查了河南省4 個地區(qū)floR、CTX－M、mcr－1 三種耐藥基因的流行情況，結(jié)果表明河南地區(qū)氟苯尼考耐藥基因floR呈現(xiàn)大流行狀況；頭孢噻呋耐藥基因CTX－M流行情況比較輕微，但呈增長趨勢；粘桿菌素耐藥基因mcr－1 在政策監(jiān)管下檢出率已經(jīng)降為0；并且不同地區(qū)耐藥基因的流行趨勢有一定差異。