于佳佳 張旭霞 張雨晴 任衛(wèi)聰 姚叢 李傳友 劉毅 唐神結(jié)

結(jié)核病是威脅人類生命健康的主要疾病，仍是全球十大死亡原因之一[1]。為實(shí)現(xiàn)2030年“終止結(jié)核病”的目標(biāo)，早期、快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷是提高結(jié)核病發(fā)現(xiàn)率和減少傳播及發(fā)病的關(guān)鍵[2]。近年來，分子核酸檢測(cè)已成為實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病廣泛應(yīng)用的重要手段[3]，如GeneXpert MTB/RIF、線性探針、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)熔解曲線和基因芯片等檢測(cè)方法，但因存在試劑貴、成本高、設(shè)備特殊、過程繁瑣，以及檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、準(zhǔn)確度和特異度較低等問題[4]，難以在基層常規(guī)開展，迫切需要開發(fā)更快速、簡(jiǎn)便、價(jià)廉的高敏感度和高特異度的新型檢測(cè)技術(shù)，以廣泛應(yīng)用于基層結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療、早控制。

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統(tǒng)是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的獲得性免疫系統(tǒng)[5-6]，其中Cas13a(CRISPR-associated 13a)蛋白具有RNA酶的活性[7]，具有獨(dú)特的靶向和切割機(jī)制，可在規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列RNA(CRISPR RNA, crRNA)的引導(dǎo)下識(shí)別單鏈核糖核酸 (single-stranded ribonucleic acid, ssRNA)[8]，非特異性剪切非目標(biāo)RNA[9-10]已被證明是一種高敏感度和高特異度的檢測(cè)方法[11-13]。本研究將已高度成熟的PCR擴(kuò)增技術(shù)與CRISPR-Cas13a檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，通過對(duì)含MTB DNA的質(zhì)粒模板、標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv及6種非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行敏感度及特異度分析，嘗試建立一種更敏感、更準(zhǔn)確、更快速、更簡(jiǎn)便的新型MTB核酸檢測(cè)方法。

材料和方法

一、研究材料

1.菌株與質(zhì)粒載體：戈登分枝桿菌(M.gordonae)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、膿腫分枝桿菌(M.abscessus)、鳥分枝桿菌(M.avium)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortui-tum)等6種非結(jié)核分枝桿菌，以及大腸埃希菌E.coli和MTB H37Rv(ATCC 25618)菌株采用本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株；質(zhì)粒載體pMD19-Tsimple Vector 購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

2.主要試劑：Cas13a蛋白由軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所贈(zèng)與；報(bào)告RNA試劑盒(RNase Alert v2, 30315288，Invitrogen公司)、鼠RNA酶抑制劑(Murine RNase inhibitor，M0314L，New England BioLabs公司)、T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase Mix，M0255A，New England BioLabs公司)、Ex Taq Version 2.0[TaKaRa, RR003，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]、RNA純化磁珠[Agencourt RNA Clean XP，Beckman Coulter，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司]、焦碳酸二乙酯處理的純水 [DEPC treated water，等同于無核酸酶水(nuclease-free water)]、[pyrogen-free，46-2224，生工生物工程(上海)有限公司]、透明96孔板(Gene Protein，OS0329，Applied Biosystems公司)、封膜(Sealing Film，F(xiàn)601418-0001，BIO-RAD公司)等。

3.主要儀器：FLUOR-CHEM E凝膠成像系統(tǒng)(ProteinSimple公司)、ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司)、DYY-3-4電泳儀(北京六一儀器廠)、Thermo Heraeus X1R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]、Eppendorf Micro 21R冷凍型微量式離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]、哈東聯(lián)BSC-1360II A2生物安全柜(浙江衛(wèi)康檢測(cè)科技有限責(zé)任公司)、HH.W21-Cr 420電熱恒溫水箱(北京長(zhǎng)安永創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司)、Axygen Maxygene-II梯度PCR儀(廣州科適特科學(xué)儀器有限公司)、梅特勒ME204電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)等。

二、研究方法

(一)構(gòu)建模擬MTB質(zhì)粒

將MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆載體，構(gòu)建含待檢測(cè)靶序列的質(zhì)粒[基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成](圖1)[14]，用于設(shè)計(jì)含IS6110保守序列的模擬MTB質(zhì)粒，以驗(yàn)證crRNA探針的有效性和特異性。

注 示意圖來源于文獻(xiàn)[14]。pMDTM19-Tsimple Vector：一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體；IS6110：MTB的保守序列。圖中可見將MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆載體，構(gòu)建含待檢測(cè)靶序列的質(zhì)粒圖1 構(gòu)建含待檢測(cè)靶序列的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

(二)設(shè)計(jì)MTB crRNA探針序列及引物

1.擴(kuò)增模板的確立：利用MTB的保守序列IS6110，設(shè)計(jì)包含重復(fù)序列和檢測(cè)靶點(diǎn)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列DNA(CRISPR DNA, crDNA)序列的擴(kuò)增模板，所需序列及引物見表1。

2.crDNA的合成、產(chǎn)物回收：將設(shè)計(jì)的crDNA擴(kuò)增模板及上下游引物加入至50 μl擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。回收擴(kuò)增后的crDNA，用紫外分光光度計(jì)(nanodrop)測(cè)定不同濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值，-80 ℃分裝備用。

3.crRNA探針的轉(zhuǎn)錄及分離：將擴(kuò)增后的含crDNA的擴(kuò)增體系充分混勻后，37 ℃轉(zhuǎn)錄過夜(轉(zhuǎn)錄體系見表2)，轉(zhuǎn)錄為實(shí)驗(yàn)所需的3條不同的crRNA，即IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA，每條crRNA設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，對(duì)構(gòu)建成功的含有MTB DNA的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)3個(gè)復(fù)孔的檢測(cè)結(jié)果取均值(3個(gè)復(fù)孔每一次循環(huán)檢測(cè)的相對(duì)熒光強(qiáng)度數(shù)值結(jié)果相加除以3得到每一循環(huán)的結(jié)果，共60個(gè)循環(huán))，比較3條不同crRNA信號(hào)的強(qiáng)弱，選擇相對(duì)熒光強(qiáng)度值最高的1條crRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。具體序列見表3。

表1 用于檢測(cè)MTB DNA的crDNA序列及引物

表2 crDNA轉(zhuǎn)錄體系

表3 用于檢測(cè)MTB DNA的crRNA 序列

4.轉(zhuǎn)錄后crRNA的純化：提前將磁珠振蕩混勻，向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入1.8倍體積的磁珠并渦旋30 s 以混勻磁珠和轉(zhuǎn)錄體系，室溫靜置3～5 min。再將反應(yīng)體系置于磁力架上，靜置5～10 min輕輕吸出體系中的液體，以分離磁珠。再向磁珠中加入70%的乙醇200 μl，室溫孵育30 s，吸出乙醇；重復(fù)此過程清洗磁珠，共3次。室溫晾干體系，去除體系中的乙醇，約10 min。加入50 μl nuclease-free water(陰性對(duì)照)溶解體系中的crRNA，渦旋30 s，吸出上清液，放入1.5 ml離心管中， nanodrop測(cè)定純化得到的crRNA濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值，-80 ℃分裝備用。

(三)建立PCR-CRISPR檢測(cè)方法和篩選crRNA序列

用特異性引物對(duì)待檢測(cè)標(biāo)本(梯度稀釋的MTB質(zhì)粒、H37Rv菌株及處理的非結(jié)核分枝桿菌)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)得到的擴(kuò)增序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳[陰性對(duì)照(NC)無條帶時(shí)，說明擴(kuò)增過程中無污染；將出現(xiàn)模糊條帶視為其檢測(cè)PCR產(chǎn)物敏感度的界值]，檢測(cè)擴(kuò)增序列是否為實(shí)驗(yàn)所需的靶序列。將特異性引物擴(kuò)增的靶序列(ssRNA，100 ng)、T7聚合酶(1 μl)、Cas13a蛋白(45 nmol/L)、crRNA(22.5 nmol/L)、NTP Buffer Mix(2 μl)、Murine RNase inhibitor(2 μl)、Background RNA(100 ng)等加入到反應(yīng)體系中，構(gòu)建不同待檢測(cè)標(biāo)本的PCR-CRISPR反應(yīng)體系，并放入熒光定量PCR儀中檢測(cè)。設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)為490 nm、37 ℃反應(yīng)15 s，發(fā)射光波長(zhǎng)為520 nm、37 ℃反應(yīng)45 s，F(xiàn)AM通道檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度變化，共60個(gè)循環(huán)。儀器自動(dòng)檢測(cè)及報(bào)告RNA相對(duì)熒光強(qiáng)度變化情況(取均值)。

(四) PCR-CRISPR方法對(duì)含有MTB IS6110片段質(zhì)粒檢測(cè)的敏感度分析

將含有MTB IS6110片段的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋(106、105、104、103、102、101、100拷貝/μl)，每個(gè)模板取1 μl進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后用T7聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，收集純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用上述建立的PCR-CRISPR方法上機(jī)檢測(cè)其相對(duì)熒光強(qiáng)度值，分析敏感度。

(五)PCR-CRISPR檢測(cè)方法對(duì)MTB 標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的檢測(cè)分析

將標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv置于羅氏培養(yǎng)基37 ℃溫箱內(nèi)進(jìn)行固體擴(kuò)大培養(yǎng)3周，刮取菌株并研磨分散以備下一步實(shí)驗(yàn)用；測(cè)量處理后的菌株吸光度值(1個(gè)吸光度值相當(dāng)于2×108CFU/ml)。對(duì)處理后的H37Rv菌株進(jìn)行梯度稀釋，得到濃度為 106、105、104、103、102、101、100拷貝/μl的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后用T7聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，收集純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，同樣按上述 PCR-CRISPR方法檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度值，分析敏感度。

(六)PCR-CRISPR檢測(cè)方法對(duì)MTB DNA特異度分析

對(duì)戈登分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌等6種非結(jié)核分枝桿菌提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用PCR-CRISPR檢測(cè)其產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度值，分析該方法的特異度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用GraphPad Prism 8.0.1(244) 繪制數(shù)據(jù)折線圖和柱狀圖。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，并采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)進(jìn)行多組數(shù)據(jù)的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果多組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)行不同檢測(cè)組與對(duì)照組差異的兩兩比較,α′水平的調(diào)整采用Bonferroni校正，α′=0.05/7。

結(jié) 果

一、PCR-CRISPR檢測(cè)含有MTB IS6110片段的模擬質(zhì)粒

將模擬MTB質(zhì)粒按照106→100拷貝/μl進(jìn)行梯度稀釋、PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，顯示無條帶的陰性對(duì)照，以及清晰可見的103～106拷貝/μl的MTB DNA模板的電泳條帶，且亮度隨濃度的升高而增加(圖2)。

注 M：marker相對(duì)分子質(zhì)量梯度；NC：陰性對(duì)照；100～106：分別為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品100～106拷貝/μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)含有MTB IS6110片段的模擬質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果

二、IS6110-crRNA探針檢測(cè)能力的比較

對(duì)MTB保守序列IS6110進(jìn)行分析后，將3條不同的crRNA(即IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA)與陰性對(duì)照分別對(duì)Cas13a 蛋白的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，IS6110-3crRNA檢測(cè)的相對(duì)熒光強(qiáng)度值從第1個(gè)循環(huán)的29 186.40 上升至第60個(gè)循環(huán)的46 184.80，M(Q1,Q3)為38 504.44(33 343.34,42 848.99)，與陰性對(duì)照[38 794.06(38 509.60，39 076.07)]相近；而IS6110-1crRNA(從39 770.85上升至397 353.57)和IS6110-2crRNA(從46 709.64 上升至104 214.52)在識(shí)別目標(biāo)核酸后均顯示出較強(qiáng)的熒光信號(hào)[相對(duì)熒光強(qiáng)度值分別為197 680.64(98 364.94,304 271.25)和82 600.00(67 014.09,94 379.19)]，分別約為陰性對(duì)照的10倍和3倍(圖3)。因此，選擇熒光信號(hào)最強(qiáng)的IS6110-1crRNA作為后續(xù)MTB DNA 檢測(cè)的crRNA。

注 NC：陰性對(duì)照?qǐng)D3 3條不同crRNA探針檢測(cè)能力的比較

三、 PCR-CRISPR方法對(duì)含有MTB IS6110片段質(zhì)粒的檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果顯示，106、105、104、103、102、101及100拷貝/μl質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度值分別從第1個(gè)循環(huán)的22 203.66、22 087.28、19 740.01、22 632.79、30 592.57、28 511.19、21 262.39 上升至第60個(gè)循環(huán)的204 670.80、149 774.88、108 329.05、98 376.96、78 644.29、51 740.02、30 263.20，M(Q1,Q3)分別為113 272.44(68 467.39，159 309.84)、80 996.82(51 021.56，114 891.18)、61 000.13(39 817.42，83 940.77)、62 308.54(41 543.18，81 014.50)、50 154.71(36 952.00，64 654.68)、38 655.34(31 975.51，45 410.32)、28 739.11(25 216.65，32 359.91)，與陰性對(duì)照[29 989.48(29 435.72，30 263.20)]總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=258.400,P<0.001)(圖4，5)，且發(fā)現(xiàn)隨著模板稀釋濃度的升高，不同濃度質(zhì)粒模板的相對(duì)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，顯示前6組質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度值均明顯高于陰性對(duì)照(Z=-8.503、-8.188、-6.986、-7.857、-9.369、-6.713，P值均<0.001)，僅100拷貝/μl質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)值與陰性對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.627，P=0.104)。

注 NC：陰性對(duì)照；100～106分別為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品100～106拷貝/μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；NS：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；***：P<0.001圖4、5 分別為PCR-CRISPR檢測(cè)MTB DNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品敏感度的折線圖和柱狀圖

四、 PCR-CRISPR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的敏感度

利用MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv進(jìn)一步評(píng)估PCR-CRISPR檢測(cè)方法的敏感度。電泳結(jié)果可見無條帶的陰性對(duì)照，以及清晰可見的104～106拷貝/μl的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)品模板電泳條帶，而103拷貝/μl時(shí)僅能觀察到模糊的條帶(圖6)。

隨后再利用梯度稀釋的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)PCR-

注 M：marker相對(duì)分子質(zhì)量梯度；NC：陰性對(duì)照；100～106分別為標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv稀釋濃度100～106拷貝/μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖6 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)H37Rv的擴(kuò)增結(jié)果

注 NC：陰性對(duì)照；100～106分別為標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv稀釋濃度100～106拷貝/μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；***：P<0.001圖7、8 分別為PCR-CRISPR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv敏感度的折線圖和柱狀圖

CRISPR檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估。106、105、104、103、102、101及100拷貝/μl的H37Rv擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度值變化分別從第1個(gè)循環(huán)的26 351.51、24 139.54、14 191.19、16 998.90、18 593.55、17 513.12、17 498.48 上升至第60個(gè)循環(huán)的89 488.21、82 411.36、63 195.01、65 233.19、41 911.39、45 363.23、18 016.47，M(Q1，Q3)分別為68 115.15(49 224.36，80 863.30)、63 205.56(45 458.62，74 907.73)、41 007.78(25 503.90，53 859.83)、37 679.07(23 630.95，52 455.66)、27 503.72(21 049.85，34 784.11)、27 571.79(20 219.58，36 395.17)、17 691.50(17 612.36，17 793.29)，與陰性對(duì)照[13 725.83(13 652.43，13 804.95)]總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=345.600,P<0.001)；且發(fā)現(xiàn)隨著H37Rv模板濃度的升高，不同濃度H37Rv模板的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖7,8)。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，顯示上述7組的相對(duì)熒光強(qiáng)度值均明顯高于陰性對(duì)照(Z值均=-9.448；P值均<0.001)。

五、PCR-CRISPR檢測(cè)MTB DNA的特異度

利用6種非結(jié)核分枝桿菌評(píng)估PCR-CRISPR檢測(cè)方法的特異度。電泳結(jié)果可見無條帶的陰性對(duì)照、6種非結(jié)核分枝桿菌電泳結(jié)果，以及清晰可見的106拷貝/μl的MTB DNA質(zhì)粒的電泳條帶(圖9)。

注 M：marker相對(duì)分子質(zhì)量梯度；NC：陰性對(duì)照；106：為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品106拷貝/μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果；1：戈登分枝桿菌；2：胞內(nèi)分枝桿菌；3：堪薩斯分枝桿菌；4：膿腫分枝桿菌；5：鳥分枝桿菌；6：偶發(fā)分枝桿菌圖9 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)6種非結(jié)核分枝桿菌及106拷貝的MTB DNA質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果

注 NC：陰性對(duì)照；106：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品106拷貝/μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；***：P<0.001圖10、11 分別為PCR-CRISPR檢測(cè)6種非結(jié)核分枝桿菌及106拷貝MTB DNA質(zhì)粒特異度的折線圖和柱狀圖

隨后利用陰性對(duì)照、6種非結(jié)核分枝桿菌及106拷貝/μl MTB DNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)PCR-CRISPR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可見，陰性對(duì)照 [37 635.57(37 168.74，38 199.20)]、戈登分枝桿菌[39 351.83(38 903.70，39 769.53)]、胞內(nèi)分枝桿菌[39 191.30(39 018.51，39 434.95)]、堪薩斯分枝桿菌[25 172.20(24 586.95，26 046.45)]、膿腫分枝桿菌[37 328.03(36 959.01，37 546.78)]、鳥分枝桿菌[37 942.29(37 455.63，38 401.13)]、偶發(fā)分枝桿菌[29 491.19(29 148.63，30 058.62)]等6種非結(jié)核分枝桿菌的相對(duì)熒光強(qiáng)度值與106拷貝/μl的MTB DNA質(zhì)粒的數(shù)值[從第1個(gè)循環(huán)的46 859.64上升至第60個(gè)循環(huán)的124 344.52，M(Q1,Q3)為89 204.07(66 253.60，108 819.13)]總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=441.900，P<0.001)；進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，顯示7組相對(duì)熒光強(qiáng)度值均明顯高于陰性對(duì)照(Z值均=-9.448，P值均<0.001)(圖10,11)。特異度良好。

討 論

結(jié)核病是引起人類死亡的重大傳染性疾病，我國(guó)目前結(jié)核病疫情仍然十分嚴(yán)峻[1]。將PCR擴(kuò)增和CRISPR-Cas13a檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合建立一種高敏感度、高特異度的核酸檢測(cè)方法，對(duì)結(jié)核病的早期及準(zhǔn)確診斷具有積極意義，為開發(fā)體外核酸檢測(cè)的高敏感度診斷工具提供了新思路，同時(shí)也為PCR-CRISPR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于臨床標(biāo)本檢測(cè)提供了重要的理論依據(jù)。

CRISPR檢測(cè)方法在病毒檢測(cè)中的開發(fā)較多，在細(xì)菌中開發(fā)較少。目前，Gootenberg等[13]建立了高敏感度和高特異度的SHERLOCK核酸檢測(cè)方法，并將之應(yīng)用于生物樣本(血液或尿液)中多種病毒的檢測(cè)；East-Seletsky等[12]利用CRISPR-Cas13a系統(tǒng)對(duì)10 pmol/L 的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)。Ai等[15]開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas12a的MTB快速檢測(cè)方法——CRISPR-MTB，并對(duì)179例患者進(jìn)行回顧性隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)CRISPR-MTB(79%)相較于培養(yǎng)(33%)和GeneXpert MTB/RIF(66%)顯示出更高的敏感度；且在不同類型的樣本中，CRISPR-MTB相較于培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF具有更強(qiáng)的整體診斷性能，為肺結(jié)核及肺外結(jié)核新的診斷技術(shù)提供了巨大的潛力；其中Cas12a可將識(shí)別的雙鏈DNA (double-stranded DNA，dsDNA)作為激活劑，并可切割單鏈DNA (single-stranded DNA，ssDNA)；但與靶向DNA的CRISPR相關(guān)酶(如Cas9a和Cas12a)不同，Cas13a能夠在切割靶RNA之后保持活性，并且可在一系列被稱作“附帶切割(collateral cleavage)”的作用中繼續(xù)切割其他的非靶向RNA。另外，CRISPR-Cas13a檢測(cè)技術(shù)也在寨卡和登革熱[16]、EBV[17]、埃博拉[18]、SARS-CoV-2[19]等病毒中顯示出較高的敏感度，提示Cas13a能夠被用來實(shí)現(xiàn)較高敏感度的檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

本研究利用PCR技術(shù)穩(wěn)定性好、實(shí)用性強(qiáng)及高效擴(kuò)增靶序列的特點(diǎn)，建立了基于PCR和CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的MTB DNA檢測(cè)方法——PCR-CRISPR。本檢測(cè)方法首先設(shè)計(jì)含IS6110保守序列的質(zhì)粒，將MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆載體，構(gòu)建含待檢測(cè)靶序列質(zhì)粒，隨后篩選出1條可用于MTB檢測(cè)的crRNA，以模擬MTB質(zhì)粒驗(yàn)證crRNA探針的有效性和特異性。然后利用PCR-CRISPR檢測(cè)方法應(yīng)用于MTB擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、crRNA 識(shí)別和 Cas13a 剪切等一系列特定過程，將擴(kuò)增后的目標(biāo)核酸進(jìn)一步放大。該檢測(cè)技術(shù)所應(yīng)用的Cas13a蛋白是RNA引導(dǎo)下的靶向單蛋白效應(yīng)器，具有獨(dú)特的RNA靶向機(jī)制，是將獨(dú)特的crRNA與靶點(diǎn)ssRNA相結(jié)合以引起Cas13a 構(gòu)象變化，從而激活Cas13a強(qiáng)大的“平行切割效應(yīng)”，使得Cas13a高效地剪切體系中的報(bào)告RNA，釋放熒光信號(hào)，通過檢測(cè)報(bào)告RNA釋放的相對(duì)熒光強(qiáng)度來判斷體系中是否存在靶序列。但需要注意的是，只有擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的ssRNA時(shí)，后續(xù)才能進(jìn)行相應(yīng)的crRNA識(shí)別及Cas13a激活等過程。基于此，即使對(duì)于低濃度的MTB DNA，也可檢測(cè)到明顯高于陰性對(duì)照的熒光信號(hào)，檢測(cè)出體系中目標(biāo)核酸的存在。

本研究顯示，PCR-CRISPR檢測(cè)MTB模擬質(zhì)粒或H37Rv菌液的相對(duì)熒光強(qiáng)度值與陰性對(duì)照，以及陰性對(duì)照和6種非結(jié)核分枝桿菌與106拷貝/μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)熒光強(qiáng)度值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該方法敏感度及特異度良好，可檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染或含有MTB。本研究利用PCR-CRISPR檢測(cè)方法檢測(cè)不同濃度質(zhì)粒模板和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的敏感度，結(jié)果顯示在拷貝數(shù)101拷貝/μl和100拷貝/μl就可以達(dá)到較好的敏感度。再通過檢測(cè)6種非結(jié)核分枝桿菌評(píng)估PCR-CRISPR檢測(cè)方法的特異度，結(jié)果顯示PCR-CRISPR同時(shí)具有較好的特異度。本研究建立了新的檢測(cè)方法和系統(tǒng)，并進(jìn)一步驗(yàn)證了該檢測(cè)方法在檢測(cè)MTB中的可行性和可靠性，下一步將利用PCR-CRISPR檢測(cè)方法對(duì)臨床菌株或患者進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估?；诘葴?cái)U(kuò)增技術(shù)開發(fā)的PCR-CRISPR檢測(cè)技術(shù)，因其核酸檢測(cè)功能具有可擴(kuò)展性和高度復(fù)用能力，可將診斷和監(jiān)測(cè)工作從樣本的定向檢測(cè)轉(zhuǎn)移到大樣本集的綜合檢測(cè)，有望在全球大部分地區(qū)實(shí)施，實(shí)現(xiàn)對(duì)感染性疾病的快速診斷。

綜上所述，基于PCR擴(kuò)增和CRISPR-Cas13a系統(tǒng)，本研究首次建立了針對(duì)MTB DNA的PCR-CRISPR核酸檢測(cè)技術(shù)，具有敏感度高、特異度強(qiáng)、穩(wěn)定性好及實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，且成本更低，有望在臨床檢測(cè)實(shí)踐中廣泛推廣。

志謝本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院流行病統(tǒng)計(jì)學(xué)室康萬里研究員指導(dǎo)！