溫度/pH響應性MPEG-b-PCL/PNVCL-b-PCL共聚物復合膠束的制備及載藥性質(zhì)

張 萌，王紹森，辛宇豪，劉 學，吳秋華，張國林

（遼寧大學化學院,沈陽110036）

具有核-殼結構的聚合物膠束可以提高藥物的溶解度、延長藥物的循環(huán)時間，在藥物控制釋放領域具有廣闊的應用前景［1～3］.但這種膠束易受溶劑、溫度、pH值和離子強度等環(huán)境因素的影響，結構遭到破壞，降低藥物傳遞的有效性并限制其應用.因此，研究和開發(fā)具有更高靈敏性和穩(wěn)定性的新型膠束越來越受到人們的關注［4～6］.

基于氫鍵的超分子共聚物膠束不僅具有常規(guī)共聚物膠束的性質(zhì)，而且其骨架中的氫鍵對外部刺激更敏感［7，8］，具有快速響應和可控釋放性質(zhì)，賦予膠束更豐富的性質(zhì)，為藥物傳遞系統(tǒng)的構建提供了新途徑［9～11］.但氫鍵本身不穩(wěn)定，使該類膠束的應用具有一定的局限性.共聚物復合膠束（CMs）是將具有不同性質(zhì)或響應性（如溫度及pH等）的ABC三嵌段共聚物或兩個二嵌段共聚物AB和BC或AB和CD引入同一膠束中，使其具有復合的“核”或“殼”結構［12］.與三嵌段共聚物相比，由兩種不同二嵌段共聚物形成的共聚物復合膠束不僅結構可由兩種嵌段共聚物的相對含量來控制，而且構成外殼的聚合物鏈段在不同條件下分別形成膠束的冠和通道，能更好地滿足藥物的控制釋放［13～15］.共聚物復合膠束雖然能夠避免普通核-殼結構膠束因環(huán)境條件變化導致的解締合，但在響應靈敏性方面存在一定的不足.我們［16］制備了以聚己內(nèi)酯（PCL）為疏水核、親水性聚乙二醇單甲醚（MPEG）和溫敏性聚N-乙烯基己內(nèi)酰胺（PNVCL）為混合殼、基于三重氫鍵的超分子共聚物復合膠束，研究了膠束在不同條件下的響應性和載藥性能，對提高共聚物復合膠束的靈敏性具有一定作用.但基于氫鍵作用的自組裝在制備和運輸過程中存在一定的不穩(wěn)定性，導致藥物包封和傳遞效率降低.亞胺鍵是酸敏感化學鍵，在中性環(huán)境（pH=7.4）中比氫鍵更穩(wěn)定，但在弱酸性環(huán)境（pH=5.0）中發(fā)生斷裂［17～19］.如果以亞胺鍵連接的嵌段共聚物為共聚物復合膠束的構筑單元，體系的靈敏度保持不變，穩(wěn)定性會顯著提高.

聚乙二醇單甲醚是一種具有良好生物相容性的聚合物，能賦予材料柔性、親水性和抗巨噬細胞吞噬等功能，已廣泛應用于生物材料等領域［20，21］.聚N-乙烯基己內(nèi)酰胺是一種溫敏性聚合物，其低臨界溶解溫度（LCST）接近人體生理溫度，由于PNVCL的酰胺基團直接連接在疏水性碳-碳主鏈上，因此水解后不會產(chǎn)生酰胺化合物，具有生物降解性和生物相容性［22～24］.聚己內(nèi)酯是由ε-己內(nèi)酯開環(huán)聚合得到的疏水性高分子，具有生物降解性、生物相容性和良好的熱穩(wěn)定性，在生物醫(yī)用材料等方面得到廣泛應用［25～27］.本文合成了基于亞胺鍵的聚乙二醇單甲醚-b-聚己內(nèi)酯（MPEG-b-PCL）和聚N-乙烯基己內(nèi)酰胺-b-聚己內(nèi)酯（PNVCL-b-PCL）嵌段共聚物，并以其為構筑單元，制備了以PCL為核、MPEG和PNVCL為殼的共聚物復合膠束，并以對其性質(zhì)進行了研究.PNVCL具有溫度響應性，室溫下其鏈段伸展，當進入血液和正常組織時，溫度高于其LCST后會發(fā)生相變而塌縮在PCL核的表面，而親水性MPEG仍然保持伸展狀態(tài)，形成帶有通道的核-殼-冠結構，避免因血液稀釋作用導致膠束解體，阻止藥物擴散釋放.當復合膠束到達弱酸性腫瘤環(huán)境時，嵌段共聚物間的亞胺鍵斷裂，膠束解體釋放藥物.通過改變兩種嵌段共聚物的比例，可以方便地調(diào)節(jié)藥物釋放速率.以基于亞胺鍵的嵌段共聚物為構筑單元的溫度/pH響應性共聚物復合膠束在藥物控制釋放領域有潛在的應用前景.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

ε-己內(nèi)酯（ε-CL，分析純）購自Alfa Aesar公司；偶氮二異丁腈（AIBN，化學純，重結晶）購自上海四赫維化工有限公司；N，N′-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC，分析純）和對二甲氨基吡啶（DMAP，分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司；辛酸亞錫［Sn（Oct）2，分析純］、對甲酰苯甲酸（p-CBA，分析純）、N-（叔丁氧羰基）乙醇胺（Boc-NHCH2CH2OH，98%）、三氟乙酸（TFA，99%）、三乙胺（TEA，99%）、聚乙二醇單甲醚（MPEG，Mn=5000，分析純）和N-乙烯基己內(nèi)酰胺（NVCL，分析純，重結晶）購自美國Sigma-Aldrich公司；巰基乙醇（HSCH2CH2OH，分析純）購自美國Amresco公司；BGC-823細胞株購自上海蓋寧生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和青鏈霉素混合液購自美國Gibico公司；噻唑藍（MTT，98%）購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和鹽酸阿霉素（DOX·HCl，98%）購自北京伊諾凱試劑有限公司；透析袋（截留分子量8000）購自上海寶曼生物技術有限公司；其它試劑為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司.

Varian Mercury 300型核磁共振波譜儀（NMR，美國Varian公司），以CDCl3作溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標；Waters 1515型凝膠滲透色譜儀（GPC，美國Waters公司），以聚苯乙烯為標樣，四氫呋喃（THF）作流動相，流速1.0 mL/min，測試溫度30℃；JEM 2100型透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）；Malvern Nano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀（英國Malvern公司）；TU-1900型紫外-可見（UVVis）分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Nikon Ts2-FL型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Tecan Infinite M1000 PRO型酶標儀（瑞士Tecan公司）.

1.2 嵌段共聚物的合成

1.2.1 端醛基聚乙二醇單甲醚（MPEG-CHO）的合成參照文獻［28］方法進行制備.將10 g（2 mmol）MPEG加入250 mL反應瓶中，用100 mL二氯甲烷溶解，然后將3 g（20 mmol）p-CBA、4.1 g（20 mmol）DCC和0.24 g（2 mmol）DMAP加入上述溶液中，磁力攪拌下于25℃反應24 h；過濾反應混合液，旋轉蒸發(fā)濃縮濾液，將得到的固體用80 mL異丙醇溶解，于4℃放置12 h；過濾，所得固體分別用異丙醇和乙醚洗滌后，于25℃真空干燥24 h，得到白色固體，產(chǎn)率78%.

1.2.2 端醛基聚N-乙烯基己內(nèi)酰胺（PNVCL-CHO）的合成將5.0 g（36 mmol）NVCL、0.081 g（0.495 mmol）AIBN和50 mL 1，4-二氧六環(huán)加入250 mL反應瓶中，攪拌溶解，充氮氣30 min；將0.078 g（1.0 mmol）HSCH2CH2OH和5 mL 1，4-二氧六環(huán)的混合溶液加入上述反應液中，磁力攪拌下于68℃反應24 h；對反應混合液減壓蒸餾以除去1，4-二氧六環(huán)，得到固體粗產(chǎn)物；將固體粗產(chǎn)物溶于20 mL二氯甲烷中，然后緩慢滴加到200 mL乙醚中得到白色沉淀，過濾；重復二氯甲烷溶解-乙醚沉淀-過濾操作3次后，將沉淀于25℃真空干燥24 h，得到白色固體端羥基聚N-乙烯基己內(nèi)酰胺（PNVCL-OH），產(chǎn)率70%.

將2.05 g（0.4 mmol）PNVCL-OH置于250 mL反應瓶中，用50 mL二氯甲烷溶解；將0.6 g（4.0 mmol）p-CBA、0.82 g（4.0 mmol）DCC和0.12 g（1.0 mmol）DMAP加入上述溶液中，磁力攪拌下于25℃反應24 h；過濾反應混合液，將濾液滴入300 mL乙醚中沉淀，過濾；重復二氯甲烷溶解-乙醚沉淀-過濾操作3次后，將沉淀于25℃真空干燥24 h，得到白色固體PNVCL-CHO，產(chǎn)率68%.

1.2.3 端氨基聚己內(nèi)酯（H2N-PCL）的合成參照文獻［29］方法制備H2N-PCL.將0.48 g（0.48 mmol）Sn（Oct）2、6.8 g（60 mmol）ε-CL、0.24 g（1.5 mmol）Boc-NHCH2CH2OH和18 mL甲苯加入反應瓶中，攪拌均勻后用液氮冷凍、抽真空、通氮氣循環(huán)操作3次后，于110℃反應12 h；反應結束后，將反應混合液滴入300 mL乙醚中得到白色沉淀；過濾，將所得固體真空干燥得端N-（叔丁氧羰基）氨基聚己內(nèi)酯（BocNH-PCL）；將BocNH-PCL在二氯甲烷/三氟乙酸（體積比1∶1）混合溶劑中室溫攪拌12 h，然后將其滴入300 mL乙醚中得到沉淀，過濾，得到H2N-PCL固體；將上述固體在二氯甲烷/三乙胺（體積比為1∶1）混合溶劑中室溫攪拌12 h，將反應混合液滴入300 mL乙醚中得到H2N-PCL沉淀，過濾、洗滌后于25℃真空干燥24 h，得到白色固體H2N-PCL，產(chǎn)率70%.

1.2.4 聚乙二醇單甲醚-b-聚己內(nèi)酯（MPEG-b-PCL）嵌段共聚物的合成將2.57 g MPEG-CHO和2.48 g H2N-PCL溶于20 mL四氫呋喃中，磁力攪拌5 min，將所得混合液滴入300 mL乙醚中得到沉淀；重復四氫呋喃溶解-乙醚沉淀-過濾操作3次后，于25℃真空干燥24 h，得到白色固體MPEG-b-PCL，產(chǎn)率74%.

1.2.5 聚N-乙烯基己內(nèi)酰胺-b-聚己內(nèi)酯（PNVCL-b-PCL）嵌段共聚物的合成將2.20 g PNVCL-CHO和2.48 g H2N-PCL溶于20 mL四氫呋喃中，磁力攪拌5 min；將所得混合液滴入300 mL乙醚中得到沉淀；重復四氫呋喃溶解-乙醚沉淀-過濾操作3次后，于25℃真空干燥24 h，得到白色固體PNVCL-b-PCL，產(chǎn)率65%.聚合物合成路線如圖S1（見本文支持信息）所示.

1.3 膠束的制備

將一定量MPEG-b-PCL、PNVCL-b-PCL（二者摩爾比分別為4∶6，5∶5，6∶4）和DOX·HCl溶解在N，N二甲基甲酰胺（DMF）中配制成1.0 mg/mL的聚合物溶液；在攪拌條件下，將上述聚合物溶液滴加到超純水中，直至水溶液由無色透明變?yōu)榉褐{光的乳白色溶液.將所得溶液透析除去DMF和未被負載的藥物，得到載藥共聚物復合膠束［CMs-DOX（4∶6，5∶5，6∶4）］.采用同樣方法制備空白CMs（4∶6，5∶5，6∶4）.利用紫外-可見分光光度計測定DOX在485 nm處的吸光度，通過標準工作曲線得到DOX的濃度，利用下式計算膠束的載藥量（DLC，%）和載藥率（DLE，%）：

式中，m1（mg）為膠束中包載DOX的質(zhì)量，m2（mg）為加入的DOX的質(zhì)量，m3（mg）為共聚物載體的質(zhì)量.

1.4 藥物體外釋放實驗

藥物體外釋放實驗分別在不同pH值的醋酸緩沖溶液（pH=5.0，0.05 mol/L）和磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7.4，0.05 mol/L）中進行：將6 mL負載藥物的膠束置于透析袋中，攪拌下置于不同溫度的14 mL相應的緩沖溶液中，每隔一段時間取出4 mL溶液，然后向瓶中補充4 mL新的緩沖溶液，保證體系外溶液的體積恒定；利用紫外-可見分光光度計測定DOX在波長485 nm處的吸光度，通過標準工作曲線得到DOX的濃度，藥物釋放率（Er，%）按下式計算：

式中，Ve（mL）為補充的緩沖溶液體積，V0（mL）為緩沖溶液總體積，Ci（μg/mL）為第i次更換溶液的DOX濃度，Cn（μg/mL）為最后一次更換溶液DOX的濃度，mDOX（μg）為膠束中DOX的總質(zhì)量.

1.5 細胞毒性實驗

采用MTT方法評價細胞毒性.將所有樣品用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成預設的濃度.在100μL RPMI-1640培養(yǎng)基中，將BGC-823細胞接種于96孔板后孵化24 h，保持每個孔板大約有1×105個細胞；用100 mL樣品溶液代替原來的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h；向每個孔板中加入20μL 5.0 mg/mL MTT溶液，孵化4 h后移除MTT；將120μL二甲基亞砜（DMSO）加入培養(yǎng)基中溶解甲瓚晶體，輕輕搖動樣品板10 min，利用酶標儀在492 nm下測定溶液的吸光度.

1.6 體外細胞內(nèi)吞實驗

在500μL RPMI-1640培養(yǎng)基中，將BGC-823細胞接種于12孔板中，保持每個孔板大約有1×105個細胞；孵化24 h后，將每個樣品板的培養(yǎng)基用500μL含有CMs-DOX（5∶5）（10μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基取代，分別孵化4，6和12 h；達到預定時間后除去培養(yǎng)基，將細胞核用DAPI染色，用500μL PBS緩沖溶液清洗3次，在熒光倒置顯微鏡下觀察.

2 結果與討論

2.1 MPEG-b-PCL嵌段共聚物的合成

圖S2（見本文支持信息）給出MPEG-CHO的1H NMR譜圖.δ3.37處的吸收峰為MPEG鏈段中甲基（—CH3）質(zhì)子的化學位移，δ3.65處的吸收峰為MPEG鏈段中亞甲基（—O—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ7.94和δ8.20處的吸收峰為苯環(huán)上質(zhì)子的化學位移，δ10.10處的吸收峰為端醛基（—CHO）質(zhì)子的化學位移，表明端羥基已經(jīng)轉化成端醛基.

圖S3（見本文支持信息）是BocNH-PCL的1H NMR譜圖.δ1.26處的吸收峰為叔丁氧羰基中甲基（—CH3）質(zhì)子的化學位移，δ1.37處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CO—CH2—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ1.66處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—CH2—CH2—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ2.32處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CO—CH2—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.48處的吸收峰為亞甲基（—NH—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.65處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ4.05處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ4.13處的吸收峰為亞甲基（—NH—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移.圖S4（見本文支持信息）是H2N-PCL的1H NMR譜圖.δ1.37處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CO—CH2—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ1.66處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—CH2—CH2—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ2.32處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CO—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.14處的吸收峰為亞甲基（H2N—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ3.65處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH—OH）質(zhì)子的化學位移，δ4.05處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ4.32處的吸收峰為亞甲基（H2N—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移.圖S5（見本文支持信息）是H2N-PCL的GPC譜圖，可以看出其為單峰，表明產(chǎn)物里沒有其它物質(zhì).綜合1H NMR和GPC結果，證明得到了H2N-PCL目標產(chǎn)物，有關數(shù)據(jù)列于表1中.

Table 1 Related data of polymers

圖1（A）為MPEG-b-PCL的結構式，圖1（C）為其1H NMR圖.圖1（C）中，δ1.36處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CO—CH2—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ1.63處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—CH2—CH2—CH2—OH）質(zhì)子 的 化 學 位移，δ2.33處 的 吸收峰為PCL鏈段中亞甲 基（—CO—CH2—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.38處的吸收峰為MPEG鏈段中甲基（—CH3）質(zhì)子的化學位移，δ3.65處的吸收峰為MPEG鏈段中亞甲基（—O—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.89處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ4.08處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ4.20處的吸收峰為亞甲基（—CH=N—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ4.52處的吸收峰為亞甲基（—CH=N—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ7.94和δ8.20處的吸收峰為苯環(huán)上質(zhì)子的化學位移，δ10.10處的吸收峰為亞胺鍵（—CH=N—）上質(zhì)子的化學位移.圖1（E）是MPEG-b-PCL的GPC譜圖.可以看出，譜線中只有一個單峰，沒有出現(xiàn)其它峰，表明生成了嵌段共聚物，產(chǎn)物里沒有其它物質(zhì).綜合1H NMR和GPC結果，證明得到了MPEG-b-PCL目標產(chǎn)物，有關數(shù)據(jù)列于表1中.

Fig.1 Chemical structures(A,B),1H NMR spectra(C,D)and GPC traces(E,F)of MPEG-b-PCL(A,C,E)and PNVCL-b-PCL(B,D,F)block copolymers

2.2 PNVCL-b-PCL嵌段共聚物的合成

圖S6（見本文支持信息）是PNVCL-OH的1H NMR譜圖.δ1.21～1.78處的吸收峰為聚乙烯鏈段中亞甲基（—CH—CH2—）和PNVCL環(huán)上亞甲基（—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ2.50處的吸收峰為PNVCL環(huán)上亞甲基（—CO—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.20處的吸收峰為PNVCL環(huán)上亞甲基（—N—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.49處的吸收峰為亞甲基（—SCH2—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ3.69處的吸收峰為亞甲基（—SCH2—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ4.40處的吸收峰為PNVCL鏈段中次甲基（—CH—CH2—）質(zhì)子的化學位移.圖S7（見本文支持信息）給出PNVCL-CHO的1H NMR譜圖.δ1.21～1.78處的吸收峰為聚乙烯鏈段中亞甲基（—CH—CH2—）和PNVCL環(huán)上亞甲基（—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ2.50處的吸收峰為PNVCL環(huán)上亞甲基（—CO—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.20處的吸收峰為PNVCL環(huán)上亞甲基（—N—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.49處的吸收峰為亞甲基（—SCH2—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ3.69處的吸收峰為亞甲基（—SCH2—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ4.40處的吸收峰為PNVCL鏈段中次甲基（—CH—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ7.90與δ8.20處的吸收峰為苯環(huán)上質(zhì)子的化學位移，δ10.07處的吸收峰為醛基（—CHO）質(zhì)子的化學位移.圖S8（見本文支持信息）是PNVCL-CHO的GPC譜圖.可以看出，PNVCL-CHO的GPC譜線呈單峰，表明產(chǎn)物里沒有其它物質(zhì).綜合1H NMR和GPC結果，證明得到了PNVCL-CHO目標產(chǎn)物，有關數(shù)據(jù)列于表1中.

圖1（B）示出了PNVCL-b-PCL的結構式，圖1（D）是其1H NMR譜圖.δ0.87～2.07處的吸收峰為聚乙烯鏈段中亞甲基（—CH—CH2—）、PNVCL環(huán)上亞甲基（—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—）和PCL鏈段中亞甲基（—CH2—CH2—CH2—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ2.30～2.48處的吸收峰為PNVCL環(huán)上亞甲基（—CO—CH2—）和PCL鏈段中亞甲基（—O=C—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.20處的吸收峰為PNVCL環(huán)上亞甲基（—N—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ3.44處的吸收峰為PCL鏈段中亞甲基（—CH2—OH）質(zhì)子的化學位移，δ3.65～4.08處的吸收峰為亞甲基（—CH=N—CH2—CH2—O—，—SCH2—CH2—OOC—）和PCL鏈段中亞甲基（—CH2—O—）質(zhì)子的化學位移，δ4.41處的吸收峰為聚乙烯鏈段中次甲基（—CH—CH2—）質(zhì)子的化學位移，δ7.94和δ8.20處的吸收峰為苯環(huán)上質(zhì)子的化學位移，δ10.10處的吸收峰為亞胺鍵（—CH=N—）質(zhì)子的化學位移.圖1（F）是PNVCL-b-PCL的GPC譜圖，為單峰，表明產(chǎn)物里沒有其它物質(zhì).綜合1H NMR和GPC結果，證明得到了PNVCL-b-PCL目標產(chǎn)物，有關數(shù)據(jù)列于表1中.

2.3 PNVCL-b-PCL的溫度響應性

圖S9（見本文支持信息）是PNVCL-b-PCL水溶液的透過率-溫度曲線.從插圖中可以看出，當溫度低于PNVCL-b-PCL的LCST時，聚合物水溶液呈澄清透明；當溫度高于聚合物的LCST時，聚合物水溶液變渾濁，表明共聚物中的PNVCL鏈段發(fā)生相變，兩親性PNVCL-PCL鏈段變成疏水性，表現(xiàn)出溫度響應性.通過測定不同溫度下聚合物溶液的透過率，以溫度對透過率作圖，得到聚合物溶液的透過率-溫度曲線，從曲線上得到PNVCL-b-PCL的LCST為35.3℃.

2.4 共聚物復合膠束的表征

圖2給出CMs的TEM照片和DLS圖.可以看出，膠束呈球形分布，粒徑較均勻，CMs（4∶6），CMs（5∶5）和CMs（6∶4）的粒徑分別為152，122和142 nm，多分散指數(shù)（PDI）分別為0.218，0.235和0.227.

Fig.2 TEM images(A—C)and DLS results(D—F)of CMs with different ratios of MPEG-b-PCL to PNVCL-b-PCL

圖3是pH=5.0醋酸緩沖溶液中CMs（5∶5）的粒徑隨時間變化曲線.由圖3（A）可以看出，CMs（5∶5）在pH=5.0緩沖溶液中發(fā)生聚集，半徑在1 h內(nèi)從130 nm增加到295 nm，4 h后約為1110 nm，24 h后達到1855 nm.由圖3（B）可見，CMs（5∶5）溶液在pH=5.0的緩沖溶液中經(jīng)過48 h后變得渾濁，而在pH=7.4的緩沖溶液中仍然保持澄清.這是由于pH=5.0時亞胺鍵發(fā)生斷裂，導致膠束解體，疏水核聚集粒徑變大；而在pH=7.4時亞胺鍵未斷裂，膠束仍然穩(wěn)定存在.（A）Time/h：a.0；b.1；c.4；d.24.（B）pH：a.7.4；b.5.0.

Fig.3 Change in size of CMs(5∶5)over time at pH of 5.0 and 25℃monitored by DLS(A)and photographs of CMs(5∶5)over 48 h at different pH values(B)

2.5 膠束的載藥與釋放

表2列出了共聚物復合膠束的載藥率與載藥量數(shù)據(jù).從表2可以看出，CMs（5∶5）的載藥率和載藥量最佳，因此選擇其作為體外釋放模型膠束.

圖4為不同條件下CMs-DOX的釋放曲線.由圖4（A）可見，在pH=7.4條件下，當溫度為25℃時，DOX的釋放速率大于其在37℃時的，這是因為PNVCL是親水性溫敏聚合物，在25℃時是水溶性，而在37℃時超過了PNVCL-b-PCL的LCST，PNVCL鏈段發(fā)生相變，形成不溶性鏈段塌縮在疏水性PCL核上，由PNVCL形成的復合膠束的殼通道關閉，因此釋放速率降低［8］.由4（B）可以看出，在37℃條件下，DOX在pH=5.0的緩沖溶液中的釋放速率大于在pH=7.4的緩沖溶液中的，這是由于在酸性條件下亞胺鍵斷裂，膠束被破壞，藥物能更快地釋放出來.由圖4（C）可見，在pH=7.4及37℃條件下，DOX的釋放速率隨著MPEG-b-PCL與PNVCL-b-PCL摩爾比的減小而減降低.這是由于隨著CMs體系中MPEG鏈段含量的減少，PNVCL的含量相對增加，MPEG通道的數(shù)量減少.

Table 2 Drug loading efficiency and drug loading content of micelles

Fig.4 In vitro drug release profiles of DOX-loaded micelles under different temperature and pH conditions

根據(jù)藥物體外釋放結果和相關文獻［13］，我們認為共聚物復合膠束的形成可能按Scheme 1所示機理進行.MPEG-b-PCL和PNVCL-b-PCL在水中自組裝形成以PCL為核、MPEG和PNVCL為混合殼的共聚物復合膠束，在室溫下親水性PNVCL鏈段伸展，當溫度高于其LCST后發(fā)生相變，塌縮在疏水性PCL核的表面，而另一親水性MPEG鏈段仍然保持伸展狀態(tài)，形成帶有通道的核-殼-冠結構.在弱酸性環(huán)境中，嵌段共聚物間的亞胺鍵斷裂，膠束解體.

Scheme 1 Schematic representation of the structure and functioning mechanism of DOX-loaded composite micelles

2.6 體外細胞內(nèi)吞作用

圖5給出BGC-823細胞在CMs-DOX（5∶5）膠束中的內(nèi)吞作用的熒光倒置顯微鏡照片.由圖5可以看出，當BGC-823細胞在CMs-DOX（5∶5）中孵化2 h時，只有少量DOX釋放，熒光強度較弱；孵化4 h后，熒光強度明顯增強；當孵化12 h后，DOX持續(xù)釋放，累積量越來越多，熒光強度進一步增強，并且

Fig.5 Inverted fluorescent microscopy images of BGC-823 cells after incubation with CMs-DOX(5∶5)at pH of 7.4 for 2 h(A1—A3),4 h(B1—B3)and 12 h(C1—C3),respectively

部分出現(xiàn)在細胞核中.由圖5（A1～A3）和（C1～C3）可以看出，CMs-DOX（5∶5）通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)部，然后DOX通過細胞核間隙釋放并擴散［11］.

2.7 細胞毒性

圖6（A）給出CMs（5∶5）對BGC-823細胞的毒性曲線.可以看出，經(jīng)過48 h后，BGC-823細胞在CMs（5∶5）中的存活率基本在90%左右，當膠束濃度達到1.0 mg/mL時，細胞存活率仍接近90%，表明CMs（5∶5）對BGC-823細胞表現(xiàn)出較低的毒性，制備復合膠束的聚合物毒性較小.圖6（B）給出DOX和CMs-DOX（5∶5）對BGC-823細胞的毒性曲線（孵化48 h）.可以看出，空白DOX的IC50值（50%細胞被殺死的濃度）是1.52μg/mL，CMs-DOX（5∶5）的IC50值是4.16μg/mL.結果表明，CMs-DOX（5∶5）能夠進入細胞中，具有比單純DOX低的細胞毒性.這主要是由于DOX從膠束中緩慢釋放延長了BGC-823細胞的內(nèi)吞作用，這由DOX的體外釋放也得到了證明.

Fig.6 Cytotoxicity of BGC-823 cells against CMs(5∶5)(A)and free DOX and CMs-DOX(5∶5)(B)after cultured for 48 h with different micelle concentrations

3 結 論

MPEG-b-PCL和PNVCL-b-PCL嵌段共聚物能夠形成以PCL為核、MPEG和PNVCL為殼的共聚物復合膠束（CMs），膠束呈球形，粒徑在100～200 nm范圍內(nèi).當MPEG-b-PCL與PNVCL-b-PCL的摩爾比為5∶5時，CMs的載藥率和載藥量最好.在正常生理溫度下，溫敏性PNVCL鏈段發(fā)生相變后塌縮在PCL核表面，親水性MPEG鏈段形成可控通道，能夠防止負載的藥物迅速釋放.亞胺鍵在正常生理條件下穩(wěn)定，在弱酸性條件時發(fā)生斷裂，膠束解體，促進藥物釋放.膠束具有較好的生物相容性，毒副作用較小，有望在藥物載體方面得到應用.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200378.