曾明 許忠 徐凱

摘要 目的：探討姜黃素對(duì)腦缺血再灌注自發(fā)性高血壓（SH）大鼠認(rèn)知功能的影響。方法：選取75只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組25只;模型組和實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，假手術(shù)組不阻塞大腦中動(dòng)脈血供;實(shí)驗(yàn)組于術(shù)前30 min及再灌注后6 h腹腔注射姜黃素100 mg/kg，假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水。檢測(cè)大鼠認(rèn)知功能、缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡及相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：缺血再灌注2～72 h，與假手術(shù)組比，模型組神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，而實(shí)驗(yàn)組較模型組減少;模型組穿臺(tái)次數(shù)減少，實(shí)驗(yàn)組多于模型組;模型組逃避潛伏期延長，實(shí)驗(yàn)組短于模型組;模型組缺血側(cè)海馬區(qū)磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白含量高于假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)組PI3K、p-AKT蛋白含量高于模型組，Caspase-3蛋白低于模型組（均P<0.05）。結(jié)論：姜黃素可減輕腦缺血再灌注SH大鼠神經(jīng)元凋亡程度，改善認(rèn)知功能，其機(jī)制與上調(diào)PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)及下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 高血壓;腦缺血再灌注;姜黃素;神經(jīng)元凋亡;認(rèn)知

Abstract Objective：To investigate the effect of curcumin on cognitive function in spontaneously hypertensive （SH） rats with cerebral ischemia reperfusion. Methods：A total of 75 cases of SH rats were selected and randomly divided into a sham operation group， a model group and a test group， with 25 cases in each group. The middle cerebral artery occlusion （MCAO） model was established in model group and test group， while the sham operation group did not block the blood supply of the middle cerebral artery; test group received intraperitoneal injection of curcumin 100 mg·kg-1 at 30 min before operation and 6 h after reperfusion， sham operation group and model group were given intraperitoneal injection of the same amount of normal saline. The cognitive function， neuronal apoptosis and the expression of related proteins in the hippocampus of the ischemic side were detected. Results：After 2 h-72 h of cerebral ischemia and reperfusion， compared with sham operation group， the number of apoptotic neurons in model group increased， while the test group was less than the model group; the number of crossings reduced， and the test group was more than the model group; the escape latency prolonged， and the test group was shorter than the model group; the content of phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）， phosphorylated protein kinase B （p-AKT） and cysteine aspartate protease-3 （Caspase-3） in ischemic side hippocampus of rats in model group were higher than those in sham operation group， while the content of PI3K and p-AKT in test group were higher than model group， Caspase-3 was lower than model group （all P<0.05）. Conclusion：Curcumin can relieve neuronal apoptosis degree and improves cognitive function in SH rats with cerebral ischemia and reperfusion， and the mechanism is related to the up-regulation of PI3K， p-AKT protein and down-regulation of Caspase-3 protein expression.

Keywords Hypertension; Cerebral ischemia reperfusion; Curcumin; Neuronal apoptosis; Cognition

中圖分類號(hào)：R285.5;R544.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.008

目前缺血性腦卒中已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病，而高血壓是腦卒中發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，缺血性腦卒中后常造成腦水腫及腦出血等再灌注損傷，影響了患者預(yù)后[1]。姜黃素具有抗炎、抗氧化等廣泛的藥理活性，且具有毒性小，不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)[2]。而目前研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)均是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，因此本研究探討姜黃素對(duì)腦缺血再灌注自發(fā)性高血壓（SH）大鼠的作用及對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡與認(rèn)知功能的影響[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 由野生型WKY大鼠基因突變后近交繁衍的SPF級(jí)SH大鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：粵檢證字第2008A053號(hào)），所有SH大鼠靜態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓>160 mm Hg（1 mmHg=0.133 kPa）。飼養(yǎng)環(huán)境：南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，濕度（55±2）%，溫度（25±2）℃，光照明暗時(shí)間比為12 h/12 h。本實(shí)驗(yàn)操作遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理審批號(hào)：2017421）。

1.1.2 藥物 姜黃素，純度99%，生產(chǎn)批號(hào)：050124，美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑與儀器 DNA斷裂的原位末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒（Merck Millipore公司，美國，貨號(hào)：AAT-22844）;磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）與磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體（Santa Cruz公司，美國，貨號(hào)：FK-CV0876R）;半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase-3）抗體（Cell Singnaling Technology公司，美國，貨號(hào)：XY-039-17401）;SH11/YF-9光學(xué)顯微鏡（Olypmus公司，日本，SH11/YF-9型）;Meta-Morph凝膠成像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics公司，美國，Meta-Morph型）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將75只SH大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=25）、模型組（n=25）和實(shí)驗(yàn)組（n=25）;模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠采用Longa法構(gòu)建腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，假手術(shù)組尼龍線栓進(jìn)線5 mm左右，不阻塞大腦中動(dòng)脈血供[4]。

1.2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組于術(shù)前30 min及再灌注后6 h腹腔注射姜黃素100 mg/kg，假手術(shù)組和模型組腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 TUNEL法[5]檢測(cè)各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 腦缺血再灌注2 h、12 h、24 h及72 h后，每組取出5只斷頭取出腦組織，制作海馬區(qū)冠狀石蠟切片，并經(jīng)脫蠟、水化處理后，按照試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)（200倍視野下），細(xì)胞核被染成黃褐色即為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核為藍(lán)色即為正常細(xì)胞。

1.2.3.2 Morris水迷宮系統(tǒng)[6]測(cè)定各組大鼠認(rèn)知功能 腦缺血再灌注7 d，采用Morris水迷宮系統(tǒng)測(cè)定各組剩余大鼠的認(rèn)知功能。第1～5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，采用Any-maze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件記錄大鼠游泳軌跡及逃避潛伏期（120 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間）;第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄120 s穿臺(tái)次數(shù)。

1.2.3.3 蛋白免疫印跡法（WB）[7]檢測(cè)各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)相關(guān)蛋白的表達(dá) 取保存的大鼠海馬組織（腦缺血再灌注24 h），制成組織勻漿，電泳后轉(zhuǎn)膜，加入PI3K、p-AKT、Caspase-3一抗，4 ℃搖床過夜，隨后室溫孵育相對(duì)應(yīng)的二抗1 h。最后用Meta-Morph凝膠成像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析，2組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 ? TUNEL細(xì)胞染色可見，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞核核質(zhì)界限清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列均勻;模型組可見細(xì)胞染色加深，分布雜亂，神經(jīng)元周圍大量空泡;實(shí)驗(yàn)組則出現(xiàn)較多正常神經(jīng)元。腦缺血再灌注2～72 h，各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞均呈逐漸升高趨勢(shì)（P<0.05）。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注2～72 h模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量增多（P<0.05），而腦缺血再灌注12～72 h實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量減少（P<0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠認(rèn)知功能的比較 假手術(shù)組、模型組及實(shí)驗(yàn)組穿臺(tái)次數(shù)（次）分別為（16.35±3.52）、（7.67±2.14）、（12.41±3.72）。與假手術(shù)組比較，模型組穿臺(tái)次數(shù)顯著減少，第1～5天的逃避潛伏期均延長（P<0.05）;與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組穿臺(tái)次數(shù)顯著增多，第1～5天逃避潛伏期均縮短（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá) 假手術(shù)組、模型組及實(shí)驗(yàn)組缺血側(cè)海馬區(qū)PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.65±0.12）、（1.97±0.52）、（2.37±0.42），p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.09）、（1.94±0.63）、（2.62±0.23），Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.12±0.05）、（1.86±0.63）、（0.51±0.22）。模型組缺血側(cè)海馬區(qū)PI3K、p-AKT、Caspase-3蛋白含量均高于假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)組缺血側(cè)海馬區(qū)PI3K、p-AKT蛋白含量高于模型組，Caspase-3蛋白低于模型組（P<0.05）。見圖3。

3 討論

腦缺血后再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要生理病理過程，也是目前臨床研究的熱點(diǎn)[8-9]。腦缺血急性期神經(jīng)細(xì)胞以凋亡與壞死并存，且海馬CA1區(qū)對(duì)缺血與低氧極為敏感，也是影響患者學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵區(qū)域[10-11]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后模型組大鼠神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，損傷嚴(yán)重，且認(rèn)知水平降低，提示腦缺血再灌注損傷SH大鼠存在明顯的神經(jīng)元凋亡及認(rèn)知缺陷。

姜黃素對(duì)肝臟、心臟缺血再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用，通過下調(diào)脂肪氧化酶、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等因子水平，抑制炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生;通過下調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達(dá)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受腫瘤壞死因子-α（TNF-α）損傷[12-13]。本研究結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組大鼠再灌注12 h、24 h、72 h時(shí)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量均較模型組減少，且認(rèn)知功能亦有所改善，表明姜黃素在一定程度上可以減輕腦缺血再灌注損傷SH大鼠的神經(jīng)元凋亡程度，促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，因此認(rèn)知功能得以改善。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞存活的重要的信號(hào)通路，也是引起缺血再灌注后細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等過程的通路[14-15]，本研究結(jié)果中，模型組海馬區(qū)PI3K、p-AKT和Caspase-3蛋白表達(dá)量增加，表明腦缺血再灌注后激活了海馬區(qū)PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用，而姜黃素的干預(yù)可進(jìn)一步活化該信號(hào)通路，降低Caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)，表明姜黃素可通過減少海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，增強(qiáng)對(duì)大鼠海馬區(qū)的保護(hù)作用;但是否存在其他的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]蔣慧.氯吡格雷對(duì)急性缺血性腦卒中患者療效及血清炎性標(biāo)記物的影響效果分析[J].貴州醫(yī)藥，2016，40（8）：828-830.

[2]王曉慧，栗亞，蔡文輝，等.基于原子力顯微鏡的姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞機(jī)械特性的影響研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015，43（2）：46-48.

[3]Wicha P，Tocharus J，Janyou A，et al.Hexahydrocurcumin protects against cerebral ischemia/reperfusion injury，attenuates inflammation，and improves antioxidant defenses in a rat stroke model[J].Plos One，2017，12（12）：189211-189225.

[4]唐強(qiáng)，姜云飛，朱路文，等.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血區(qū)堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管抑制素蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2015，21（10）：1151-1155.

[5]周廣平，郝俊杰，李穎，等.左乙拉西坦對(duì)小鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J].中華腦科疾病與康復(fù)雜志（連續(xù)型電子期刊），2016，6（2）：83-88.

[6]賈立娜，于魯璐，陳欠欠，等.丹參多酚酸對(duì)抑郁模型大鼠認(rèn)知功能的改善作用[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2016，25（4）：289-294.

[7]周娜，趙雅寧，李佳寧，等.跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)CyclinA和CyclinE蛋白表達(dá)的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2016，25（2）：112-116.

[8]孫亞蒙，張燕，莫云，等.缺血后處理抑制神經(jīng)元凋亡減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2018，26（3）：8-16.

[9]王國峰，劉伯芹，王濱，等.PI3K/Akt信號(hào)通路在肢體缺血后處理減輕腦缺血再灌注損傷中的實(shí)驗(yàn)研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2018，35（11）：983-988.

[10]呂建國，孫燕玲.大鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡及銀杏葉提取物的保護(hù)作用[J].解剖學(xué)雜志，2018，41（4）：395-399.

[11]陳曉莉，陳瑞利，郭曉敏，等.丁苯酞對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞壞死性凋亡的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2019，28（2）：122.

[12]曲雅靜，董化江，臧照輝，等.姜黃素對(duì)急性心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)皮素-1水平的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，32（8）：707-709.

[13]咸國哲，吳曉本，劉景磊，等.姜黃素對(duì)大鼠移植肝缺血再灌注損傷指標(biāo)血紅素氧合酶-1表達(dá)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（1）：193-193.

[14]李帥帥，孫軍.PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路在姜黃素抑制人肝癌細(xì)胞Cox-2表達(dá)中的作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2014，39（1）：30-34.

[15]高強(qiáng).JAK/STAT和PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響及兩信號(hào)通路之間的關(guān)系[D].杭州：浙江大學(xué)，2014.

（2020-09-22收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）