韓小娟，趙 玥，田洪倫，何 軍

（1.貴州省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽(yáng) 550004；2.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035）

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有簡(jiǎn)便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)而被臨床廣泛運(yùn)用[1-3]。近年來(lái)，由于全自動(dòng)酶免分析儀能減少人工成本及人為操作誤差，使檢測(cè)流程更加標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，提高檢測(cè)結(jié)果的精確性和可溯源性，因此在臨床檢驗(yàn)中受到廣泛應(yīng)用。但全自動(dòng)酶免儀樣本孵育時(shí)間長(zhǎng)，影響臨床樣本檢測(cè)效率。酶標(biāo)板快速孵育器因能縮短孵育時(shí)間，提高工作效率，在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來(lái)越多，但快速孵育法仍需要人工加樣，增加了人工參與造成的誤差。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器檢測(cè)乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），探討優(yōu)化ELISA 操作流程在臨床檢驗(yàn)中的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年1月～2019年9月經(jīng)化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)HBsAg 陽(yáng)性高值（≥250 IU/ml）、中 值（101～250 IU/ml）、低 值（0.05～100 IU/ml）樣本各50 例，HBsAg 陰性樣本50 例。其中男性112 例，女性88 例，年齡4 ～93 歲，平均年齡46 歲。

1.2 儀器與試劑 四川邁克i3000 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，嘉興科瑞迪全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀（HB-500E)，成都蓋森酶標(biāo)板快速孵育器（MKF-6)。邁克生物股份有限公司化學(xué)發(fā)光法乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司酶聯(lián)免疫法乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 所有收集的血清樣本均保存于-80℃低溫冰箱中直至分析。取出待檢樣本置于室溫至完全融化混勻，待測(cè)。

1.3.2 化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)HBsAg (C 法)： 按照邁克生物股份有限公司乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)和儀器SOP 操作，并嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 ELISA 定性檢測(cè)HBsAg：試劑盒室溫放置30min 后分別用四種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，A 法：使用全自動(dòng)酶免分析儀進(jìn)行孵育檢測(cè)；B1，B2，B3 法：均使用全自動(dòng)酶免分析儀加樣、加試劑、洗板、比色，孵育時(shí)轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板快速孵育器進(jìn)行孵育，其中B1 法孵育時(shí)間為說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間的1/2，B2法孵育時(shí)間為說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間的1/3，B3 法孵育時(shí)間為說(shuō)明書(shū)規(guī)定時(shí)間的1/4，具體孵育時(shí)間見(jiàn)表1，其他操作步驟嚴(yán)格遵守試劑盒說(shuō)明書(shū)和儀器SOP 進(jìn)行。

1.3.4 計(jì)算每份樣本的S/CO 值：以S/CO 值≥1時(shí)判斷為樣本HBsAg 陽(yáng)性，S/CO 值＜1 時(shí)判斷為樣本HBsAg 陰性。A，B1，B2，B3 法分別與化學(xué)發(fā)光法（C 法）進(jìn)行差異比較，同時(shí)計(jì)算各方法的總樣本符合率、敏感度和特異度。

表1 各方法實(shí)驗(yàn)孵育時(shí)間

1.3.5 精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)：選用試劑盒配套的HBsAg陰陽(yáng)性對(duì)照及第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控品，使用 ELISA(A，B1，B2，B3 法)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)控品連續(xù)重復(fù)測(cè)定20 次，計(jì)算變異系數(shù)（CV%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間差異的比較采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各方法檢測(cè)HBsAg 精密度結(jié)果 見(jiàn)表2。根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求，陰性對(duì)照結(jié)果吸光度值＜0.10、陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果吸光度值＞0.80 時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控S/CO 值為2 ～5 有效。20 次質(zhì)控實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照結(jié)果吸光度均值0.008，陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果吸光度均值3.68，第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控S/CO均值為3.98，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。A，B1，B2，B3 法批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（精密度）判斷標(biāo)準(zhǔn)為說(shuō)明書(shū)要求的精密度變異系數(shù)（CV%）≤15%，均在要求以內(nèi)。

表2 各方法對(duì)HBsAg 的精密度檢測(cè)（CV%)

2.2 各方法檢測(cè)HBsAg 定性結(jié)果 見(jiàn)表3。各方法與化學(xué)發(fā)光法（C 法）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，只有全自動(dòng)酶免儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器孵育時(shí)間縮短1/2（B1 法）時(shí)的陰陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法完全一致，全自動(dòng)酶免儀單獨(dú)檢測(cè)（A法）時(shí)陰性結(jié)果一致，陽(yáng)性結(jié)果有2 例不一致。但所有結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0～0.323，均P＞0.05）。

2.3 各方法檢測(cè)HBsAg 總樣本符合率、敏感度、特異度情況 見(jiàn)表4 。

表3 各方法檢測(cè)HBsAg 定性結(jié)果（n=200）

表4 各方法檢測(cè)HBsAg 總樣本符合率、敏感度、特異度情況(%)

3 討論

基于ELISA 具有成本低、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，因而ELISA 的臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目在各級(jí)醫(yī)院都得到廣泛開(kāi)展。近年來(lái)，同一ELISA 檢測(cè)方法在不同檢測(cè)系統(tǒng)間的陽(yáng)性符合率也越來(lái)越得到人們關(guān)注[4]。在ELISA 實(shí)驗(yàn)中，孵育是檢測(cè)中影響檢測(cè)成敗的最關(guān)鍵因素之一[5]，因此，在確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，優(yōu)化檢測(cè)流程和縮短檢測(cè)時(shí)間對(duì)臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作有重要的參考意義。

本研究以化學(xué)發(fā)光法作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，本次實(shí)驗(yàn)收集所有樣本的乙肝血清學(xué)模式均為HBsAg，HBeAg 和HBcAb 陽(yáng)性或HBsAg，HBeAb 和HBcAb陽(yáng)性。本次實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器新流程。新流程在縮短1/2 時(shí)間的情況下，其檢測(cè)HBsAg 項(xiàng)目的敏感度比單純的全自動(dòng)酶免分析儀敏感度更高。由此可見(jiàn)，新流程極大地縮短了檢驗(yàn)項(xiàng)目的時(shí)長(zhǎng)，減少了臨床醫(yī)生和患者的等待時(shí)間。當(dāng)新流程將孵育時(shí)間縮短為原規(guī)定時(shí)間的1/3 和1/4 時(shí)，雖然和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但敏感度相對(duì)較低，有陽(yáng)性漏檢的可能，所以不推薦將孵育時(shí)間縮短為原時(shí)間的1/3 和1/4。

本研究還發(fā)現(xiàn)，全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器檢測(cè)一些低滴度陽(yáng)性標(biāo)本中的敏感度高于全自動(dòng)酶免分析儀，其原因可能為酶標(biāo)板快速孵育器的升溫原理不一樣。酶標(biāo)板快速孵育器的原理主要是通過(guò)發(fā)熱模塊產(chǎn)生空氣循環(huán)加熱，使用多個(gè)方向風(fēng)扇旋轉(zhuǎn)使孵育腔內(nèi)形成流動(dòng)氣體，保證溫度的均勻性，且孵育全過(guò)程中結(jié)合振蕩，促進(jìn)抗原抗體結(jié)合，能一定程度上增加試劑的靈敏度[6]。而全自動(dòng)酶免儀孵育室只有微孔板金屬載架加溫，反應(yīng)板孔受熱不均勻，孵育室整體空間比較大，升溫曲線較慢，溫度不準(zhǔn)確，以及反應(yīng)板周?chē)h(huán)境可達(dá)到預(yù)期溫度而孔內(nèi)溫度不能達(dá)到預(yù)期溫度[7-8]。因此，在孵育過(guò)程中其實(shí)有大量的時(shí)間是用于升溫過(guò)程，而最佳孵育段的時(shí)間并沒(méi)有那么長(zhǎng)。由此，金屬底板單面加熱可能是ELISA 自動(dòng)化儀器的缺陷[9]。

研究中，HBsAg 含量越低，快速孵育縮短的時(shí)間越短，ELISA 漏檢率越高。本文結(jié)果與劉麗等[6]人的研究結(jié)果相比，縮短1/3 時(shí)間敏感度略有不同，可能與本文所選取的低值樣本較多和儀器試劑的敏感度不同有關(guān)。且本實(shí)驗(yàn)除孵育環(huán)節(jié)不一致外，其它步驟均由同一儀器操作完成，減少了實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差和偶然誤差，使結(jié)果更具可比性。

通過(guò)本研究證實(shí)，優(yōu)化后的全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器的方法檢測(cè)HBsAg，將孵育時(shí)間縮短至規(guī)定時(shí)間的1/2，在確保結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)，縮短了整個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目的檢測(cè)時(shí)間，提高了工作效率，這對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。