復(fù)明湯調(diào)控TGF-β1/Smad3通路抑制肺成纖維細(xì)胞活化及肺上皮損傷減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化*

余洪剛，付大海，楊利生，宋 超，唐俊峰，秦曉娟

（1.西安市中醫(yī)醫(yī)院肺病科，西安 710012；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理學(xué)研究室，咸陽 712000；3.漢中市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，漢中 723000）

特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種上皮纖維母細(xì)胞性疾病，是由于肺泡上皮細(xì)胞受到多種微小損傷并隨后誘導(dǎo)過度的成纖維細(xì)胞活性所致[1-2]。肺上皮損傷后，重要的纖維變性介質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）由上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞類型釋放[3]，在博來霉素?fù)p傷的小鼠和IPF患者的肺組織中均顯著上調(diào)[4-6]。研究前期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)復(fù)明湯（FMT）治療肺纖維化療效確切，其出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，重用補(bǔ)氣藥與少量活血藥相伍，佐以通絡(luò)平喘，補(bǔ)氣而不壅滯，活血亦不傷正，合而用之，諸癥向愈，臨床治療肺纖維化療效確切，然而其作用機(jī)制不明限制其臨床應(yīng)用。本研究擬闡明FMT在體外對TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞活化和上皮損傷的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證FMT在博萊霉素?fù)p傷的小鼠體內(nèi)在肺纖維化中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 復(fù)明湯制備 枸杞子、女貞子、丹參、當(dāng)歸、決明子各15 g，菟絲子、牡丹皮、茯苓、白術(shù)、菊花、木賊、石菖蒲各 10 g，黃芪 12 g，三七 6 g，甘草 6 g，加入10倍量蒸餾水浸泡30 min后煎煮2次，每次90 min，合并后，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮，使生藥濃度分別為 1、2、3、4 和 5 g/mL 的 FMT。

1.2 細(xì)胞系和小鼠 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3，小鼠肺成纖維細(xì)胞MLg和人肺泡上皮細(xì)胞（AEC）A549系從ATCC獲得。用CAGA熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，以生成CAGA-NIH-3T3報(bào)告細(xì)胞。在37℃的恒溫箱中，在含10%胎牛血清（FBS）和抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL鏈霉素）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。8周齡的雄性C57BL/6 J小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。將所有小鼠飼養(yǎng)于無病原體設(shè)施中。所有手術(shù)均在7.5%水合氯醛麻醉下進(jìn)行。

1.3 博來霉素的給藥和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 小鼠肺纖維化模型參照文獻(xiàn)建立[7]。簡而言之，小鼠以10%烏拉坦腹腔麻醉后，向小鼠氣管內(nèi)注射溶解在生理鹽水（0.9%NaCl）中的單劑量博來霉素（2.5或 5 U/kg），注射后迅速將小鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺中均勻分布，待動物自然清醒后，隨機(jī)分為兩組，對照組和FMT組。FMT組小鼠經(jīng)灌胃給予2 mL 5 g/mL的FMT，而對照組小鼠則給予等體積的蒸餾水。在博來霉素處理后的指定時(shí)間，處死小鼠用于隨后的實(shí)驗(yàn)。

1.4 熒光素酶測定 CAGA-NIH-3T3細(xì)胞接種在96孔板中，達(dá)到80%融合后，血清饑餓24 h。此后，在含0.1%FBS的DMEM中用不同生藥濃度的FMT處理細(xì)胞1 h，并用5 ng/mL TGF-β1處理細(xì)胞24 h。在處理結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞裂解并在雙熒光素酶報(bào)告基因測定（Promega）中測定。反應(yīng)的最初20 s期間的總發(fā)光在照度光度計(jì)中測量。

1.5 細(xì)胞活力分析 將MLg細(xì)胞接種在96孔板中，并用不同生藥濃度的FMT預(yù)處理1h，然后在有或無TGF-β1（10 ng/mL）的條件下共培養(yǎng)，使用 3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性測定試劑盒確定細(xì)胞活力。

1.6 RNA提取和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) 使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。使用隨機(jī)寡核苷酸引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA）。qRT-PCR以20 μL的體積進(jìn)行，其中包含5 pmol引物，10 ng cDNA和SYBR Green PCR主混合物。使用2-ΔΔCt方法相對于β-actin確定基因表達(dá)。靶基因及其引物序列如下。Acta2：5’-GCTGGTGATGATGCTCCCA-3’和 5’-GCCCATTCCAACCATTACTCC-3’；Col1a1：5’-CCAAGAAGACATCCCTGAAGTCA-3’和 5’-TGCACGTCATCGCACACACA-3’；Fn1：5’-GTGTAGCACAACTTCCAATTACGAA-3’和 5’-GGAATTTCCGCCTCGAGTCT-3’；Actb（細(xì)胞）：5’-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3’和 5’-AGAGCATAGCCCTCGTAGATGG-3’；CDH1：5’-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3’和 5’-TGCACGTCATCGCACACA-3’；CDH2：5’-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3’和 5’-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3’；SNAI1：5’-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3’和 5’-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3’；ACTB（動物）：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’和 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.7 蛋白印跡（Western blot）法 從細(xì)胞和培養(yǎng)上清液中提取蛋白質(zhì)，收集培養(yǎng)基并在4℃下以14 000×g離心3 min以去收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液從培養(yǎng)基中獲得總蛋白，并使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)到PVDF膜上。將膜在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，并在4℃下與一抗孵育過夜。磷酸化（p）-Smad2（3108），Smad2（3122），p-Smad3（9520），Smad3（9513），ERK（4370S），ERK（4695），p-p38（4631S），p38（9212），p-c-Jun N-terminalkinase（JNK；9251S），JNK（9252），E-cadherin（3195），N-cadherin（13116）和 SNAIL（3879）購自CellSignalingTechnology。Type1collagen（ab21286）和 fibronectin（ab2413）抗體購自 Abcam。GAPDH（UM4002）和 β-tubulin（UM4003）抗體購自Utibody Biotechnology。α-SMA（sc-32251）抗體購自Santa Cruz Biotechnology，β -actin（AC026）抗 體購自ABclonal Technology。隨后，將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h，并使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce）檢測蛋白質(zhì)信號。

1.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 通過劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)評估遷移。MLg細(xì)胞是接種在6孔板中并培養(yǎng)24 h。用無菌微量移液器吸頭刮擦細(xì)胞單層后，在存在和不存在TGF-β1（10 ng/mL）的情況下，用 FMT（5 g/mL）處理細(xì)胞36 h于顯微鏡下觀察，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.9 肺功能評估 使用Anires2005系統(tǒng)對小鼠進(jìn)行麻醉，氣管切開，并用計(jì)算機(jī)控制的小動物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，以確定肺功能。該系統(tǒng)可以自動計(jì)算并顯示肺參數(shù)，例如呼吸動態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）、肺阻力（RL）和呼氣阻力（RE）。

1.10 組織學(xué)檢查 左肺以0.4 mL 10%福爾馬林固定。將組織固定過夜，包埋在石蠟中，然后切片以用蘇木精伊紅（HE）或Masson 3色染色。使用ImagePro Plus 6.0 軟件（Media Cyber netics）分析數(shù)字圖像，概述肺的總體和纖維化區(qū)域，并對每個(gè)肺的纖維化像素相對于總像素進(jìn)行求和，以獲得纖維化的百分比。

1.11 羥脯氨酸測定 使用常規(guī)羥脯氨酸方法在右肺中清除血液中的膠原蛋白含量。將肺在120℃下干燥16 h時(shí)，將切碎于3 mL 6 N HCl中的肺組織在120°C下再孵育16 h。然后將樣品冷卻并通過5.0 μm注射過濾器過濾，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至 6.5～8.0。隨后，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）至總體積為10 mL，并通過分光光度法測量吸光度，用氯胺-T進(jìn)行羥脯氨酸測定。使用含有已知量的純化膠原蛋白的樣品確定膠原蛋白水解的完全性和羥脯氨酸的回收率。

1.12 支氣管肺泡灌洗液收集和細(xì)胞計(jì)數(shù) 將氣管插管并在室溫下用0.8 mL無菌PBS灌洗3次。將樣品以300×g離心5 min，并收集無細(xì)胞的上清液。沉淀以PBS洗滌，然后懸浮在200 μL PBS中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和異細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)。對于不同的細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)懸浮液的涂片均用HE染色，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將500個(gè)細(xì)胞分類為巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。

1.13 酶聯(lián)免疫吸附測定 使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（BioLegend，USA），根據(jù)說明書測量BALF 中白細(xì)胞介素（IL）-1β，干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。將BALF樣品添加至包被有捕獲抗體的測定板的孔中。過夜孵育后，將測定板洗滌3次，并加入檢測抗體。在室溫下孵育1 h并洗板3次后，將抗生蛋白鏈菌素-HRP加入孔中。用四甲基聯(lián)苯胺底物顯色，并在450、570 nm下測量吸光度。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較進(jìn)行Dunn檢驗(yàn)，使用對數(shù)秩檢驗(yàn)比較生存曲線，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FMT抑制TGF-β1激活的Smad3信號傳導(dǎo) 評估FMT對用（CAGA）12-熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞中TGF-β1信號通路的影響，其包含12個(gè)Smad結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，該報(bào)告基因在TGF-β1處理后被激活，但被FMT以濃度依賴的方式抑制，表明FMT可通過拮抗TGF-β1信號通路發(fā)揮其潛在抗纖維化作用。見圖1A。

為進(jìn)一步探索細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，研究了FMT對小鼠肺成纖維細(xì)胞MLg細(xì)胞系中Smad2/3依賴途徑和非Smad信號傳導(dǎo)（如MAPK級聯(lián)）的影響。TGF-β1有效地增加了磷酸化的Smad2、ERK1/2、JNK和p38的水平，并可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3磷酸化，同時(shí)對TGF-β1誘導(dǎo)的其他下游因子的磷酸化作用較小。結(jié)果表明，F(xiàn)MT主要通過抑制典型的TGF-β1-Smad2/3途徑，特別是通過抑制Smad3活化來阻斷TGF-β1信號傳導(dǎo)。見圖1B。

圖1 復(fù)明湯在體外抑制TGF-β1激活的Smad3信號傳導(dǎo)Fig.1 Fuming decoction inhibits Smad3 signaling by TGF-β1 activation in vitro

2.2 FMT減弱TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞活化 成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞是主要的反射細(xì)胞，在組織損傷后和IPF患者中被激活，導(dǎo)致ECM產(chǎn)生增加和遷移潛力增強(qiáng)。為了檢查FMT是否介導(dǎo)了與成纖維細(xì)胞活化有關(guān)的TGF-β1信號傳導(dǎo)阻滯，建立經(jīng)TGF-β1處理的成纖維細(xì)胞體外模型。FMT的生藥濃度范圍為1～5 g/mL，在生藥濃度＞2 g/mL時(shí)對MLg細(xì)胞的生存能力具有更大的影響，見圖2A。如圖2B和E所示，在TGF-β1處理后，α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，但在FMT干預(yù)下顯著降低，表明FMT抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的成肌纖維細(xì)胞分化。TGF-β1增加了兩種主要ECM成分的Ⅰ型膠原和纖連蛋白的mRNA和蛋白質(zhì)水平，當(dāng)用FMT治療時(shí)，它們的表達(dá)顯著降低，見圖2C、D、E。另外，圖2F和圖2G顯示，F(xiàn)MT處理36 h后，TGF-β1刺激的成纖維細(xì)胞遷移速率降低，表明FMT抑制成纖維細(xì)胞遷移。

2.3 FMT減輕TGF-β1誘導(dǎo)的肺上皮損傷 研究表明，肺泡上皮細(xì)胞（AEC）損傷可能是肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的重要早期特征。受損的AECs被激活并可能經(jīng)歷許多細(xì)胞和分子變化，例如同時(shí)丟失上皮標(biāo)記和獲得間充質(zhì)標(biāo)記[8]。為了確定FMT對TGF-β1信號的阻斷是否導(dǎo)致對上皮損傷的保護(hù)，向TGF-β1處理的A549細(xì)胞中添加了FMT。結(jié)果表明，TGF-β1誘導(dǎo)了上皮激活，表現(xiàn)為上皮標(biāo)記物（E-cadherin）的表達(dá)減少、間充質(zhì)標(biāo)記物（N-cadherin）的表達(dá)增加及TGF-β的增加β1下游轉(zhuǎn)錄因子SNAIL。FMT干預(yù)以濃度和時(shí)間依賴性方式顯著抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的上皮損傷，見圖3A和B。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析進(jìn)一步證明，TGF-β1在A549細(xì)胞中顯著下調(diào)E-鈣黏蛋白的mRNA表達(dá)，并上調(diào)N-鈣黏蛋白和SNAIL的表達(dá)，見圖3C、D、E，表明FMT可保護(hù)肺泡上皮A549細(xì)胞免受TGF-β1誘導(dǎo)的損傷。

圖2 復(fù)明湯體外抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化、ECM產(chǎn)生及成纖維細(xì)胞遷移Fig.2 Fuming decoction inhibits TGF-β1 induced fibroblast activation，ECM production，and fibroblast migration in vitro

2.4 FMT減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化 在體內(nèi)進(jìn)一步評估了FMT的抗纖維化作用。經(jīng)氣管內(nèi)施用博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)FMT治療的小鼠對大劑量博來霉素（5 U/kg）誘導(dǎo)的肺損傷的敏感性顯著降低，表現(xiàn)出更好的存活率，見圖4A和B。而且，經(jīng)FMT處理的小鼠表現(xiàn)出肺功能的改善，如Cdyn升高和RL/RE值降低，見圖4C、D、E。與僅用博來霉素處理的小鼠（2.5 U/kg）相比，博來霉素處理后7 d經(jīng)FMT治療的小鼠可恢復(fù)纖維化誘導(dǎo)的體質(zhì)量減輕和膠原蛋白減少確定，見圖5A、B、C、D。對肺纖維化切片的面積進(jìn)行定量，說明了FMT治療后肺纖維化減弱，見圖5E。Col1和α-SMA蛋白水平降低進(jìn)一步支持FMT處理可減輕小鼠中肺纖維化，見圖5F。同時(shí)檢查FMT對體內(nèi)Smad2/3磷酸化水平的影響，發(fā)現(xiàn)FMT可顯著降低由博來霉素誘導(dǎo)的磷酸化Smad3，證實(shí)其可通過抑制TGF-β1信號通路改善纖維化，見圖5G。

為了評估FMT是否可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)建立的纖維化，在博萊霉素處理后14 d給藥FMT，1周后處死小鼠，并收集樣品用于纖維化分析，見圖6A。結(jié)果表明FMT可顯著減少肺纖維化，見圖6B、C、D、E。

3 討論

中藥目前被認(rèn)為是用于藥物篩選和開發(fā)的寶貴資源，并且已經(jīng)開發(fā)出旨在干擾TGF-β1信號通路的策略來治療IPF。研究表明黃芩苷和大黃素可以減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[9-10]，而丹酚酸B能夠保護(hù)百草枯引起的肺損傷[11]，其作用機(jī)制均與TGF-β1信號的失活有關(guān)。本研究從多方面證實(shí)FMT對進(jìn)行性肺纖維化具有抗纖維化作用，F(xiàn)MT可拮抗TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低Smad3磷酸化水平，在體外抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的上皮損傷、成肌纖維細(xì)胞活化、ECM產(chǎn)生、成纖維細(xì)胞遷移，并最終在體內(nèi)證實(shí)上述活性。

圖3 復(fù)明湯體外抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮損傷Fig.3 Fuming decoction inhibits TGF-β1 induced epithelial damage in vitro

圖4 FMT提高博來霉素?fù)p傷小鼠的存活率并改善其肺功能Fig.4 Fuming decoction improves the survival rate of bleomycin(BLM)injured mice and improves their lung function

圖5 FMT減弱博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的產(chǎn)生Fig.5 Fuming decoction attenuates bleomycin(BLM)-induced lung fibrosis in mice

圖6 FMT可減弱博來霉素誘導(dǎo)的已成型小鼠肺纖維化Fig.6 Fuming decoction can attenuate bleomycin(BLM)-induced formed pulmonary fibrosis in mice

TGF-β1通過刺激其下游介質(zhì)Smad2/3發(fā)揮其在器官纖維化（包括肺纖維化）中的生物學(xué)活性[12]，這兩種Smad在ECM產(chǎn)生和組織纖維化中具有不同的作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外和體內(nèi)模型中Smad3而非Smad2是FMT靶向的潛在細(xì)胞內(nèi)傳感器，與最近相關(guān)研究結(jié)果一致，Smad3為ECM產(chǎn)生和組織纖維化中TGF-β1信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)[15-16]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)FMT可通過對AEC損傷以及對成纖維細(xì)胞分化和活化的作用來減輕肺纖維化，其可顯著逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的成肌纖維細(xì)胞分化，ECM產(chǎn)生和體外成纖維細(xì)胞遷移，從而抑制成纖維細(xì)胞的功能。這些作用可能是FMT抵抗博來霉素在體內(nèi)的纖維化作用能力的基礎(chǔ)，甚至可以減少博來霉素誘導(dǎo)已形成的纖維化。同時(shí)，當(dāng)進(jìn)行預(yù)防性應(yīng)用時(shí)，F(xiàn)MT對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化沒有保護(hù)作用。IPF一度被認(rèn)為是一種非炎性疾病，因?yàn)榉卫w維化不能對皮質(zhì)類固醇激素療法產(chǎn)生反應(yīng)[17]。然而，最近對免疫細(xì)胞功能的研究導(dǎo)致重新評估了炎癥細(xì)胞在肺纖維化發(fā)展中的作用。而FMT似乎并未影響博來霉素模型中炎性細(xì)胞的初始流入和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這提示FMT可以在不加劇炎癥的劑量下減輕纖維化，從而避免了與全面抑制TGF-β1相關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究表明FMT可減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化和功能障礙，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控TGF-β1/Smad3信號通路，進(jìn)而保護(hù)上皮損傷、抑制成肌纖維細(xì)胞分化、ECM沉積和成纖維細(xì)胞遷移。結(jié)合中藥復(fù)方的低毒性及逆轉(zhuǎn)肺纖維化的能力，F(xiàn)MT具有臨床治療進(jìn)行性肺纖維化患者的潛力，本研究為FMT治療肺纖維化的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。