趙 璐 倪依群 尤建良

慢性心理應(yīng)激能促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展，在應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體釋放大量腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、皮質(zhì)醇等激素至外周血中。其中，去甲腎上腺素作為一種經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)，能提高腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過β-腎上腺素能受體(β-adrenergic receptor，β-AR)信號通路使腫瘤的生物學(xué)行為和腫瘤所處的微環(huán)境發(fā)生改變[1～3]。一方面促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等物質(zhì)的生成，提高腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力，另一方面抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，降低自然殺傷細(xì)胞(natural killer, NK)及T細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性，最終促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。本研究旨在觀察去甲腎上腺素通過β-AR信號通路對人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29侵襲能力的影響及可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.主要材料與試劑：人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株(ATCC)；McCoy′s 5A培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品、普萘洛爾標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(中國碧云天生物公司)；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell(8μm)小室(美國BD公司)；鼠抗人MMP-2(ab86607)、MMP-9(ab58803)、VEGF(ab69479)單克隆抗體(美國Abcam公司)；ERK1/2(4696)、p-ERK1/2(4370)單克隆抗體(美國CST公司)；反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物由華大基因合成，引物序列詳見表1。

表1 引物序列

2.細(xì)胞培養(yǎng)：HT-29細(xì)胞用含10%胎牛血清的McCoy′s 5A培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶常規(guī)消化傳代。

3.細(xì)胞增殖能力檢測實驗：采用CCK-8法，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1.0×105個/毫升按每孔100μl 接種于96孔板，培養(yǎng)細(xì)胞融合至50%～60%，隨機(jī)分為空白組和去甲腎上腺素組(0.1、1、10、100μmol/L)，每組設(shè)3個復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，空白組加入含10%血清培養(yǎng)基200μl，各去甲腎上腺素組加入含相應(yīng)藥物濃度的含10%血清培養(yǎng)基200μl。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24及48h后加入CCK-8試劑20μl，繼續(xù)避光培養(yǎng)2h。使用酶標(biāo)儀于450nm波長處測定各孔吸光值，計算細(xì)胞存活率：存活率=(空白組平均A值-藥物組平均A值)/空白組平均A值×100%。

4.Transwell侵襲實驗：50mg/L Martigel基質(zhì)膠以1∶8稀釋包被Transwell小室上室面，4℃風(fēng)干后吸棄小室中殘余液體，每孔加入50μl含10g/L 牛血清白蛋白(BSA)的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育30min。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基饑餓12h后消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，取200μl接種于包被及水化后的Transwell上室，分別加入無血清培養(yǎng)基、含0.1μmol/L去甲腎上腺素、1μmol/L去甲腎上腺素、10μmol/L去甲腎上腺素的McCoy′s 5A培養(yǎng)基。下室均加入500μl 含10%血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后取出Transwell小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，PBS液沖洗3次，4%多聚甲醛固定15min，4g/L結(jié)晶紫溶液染色。顯微鏡下觀察并計算穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果判定：200倍鏡下計算5個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值，并計算細(xì)胞的侵襲率。侵襲率=實驗組細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù)×100%。

5.反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR：藥物干預(yù)48h后，TRIzol提取各組細(xì)胞中的總RNA，采用SYBR GreenERTMqPCR SuperMix Universal檢測細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：50℃ 30min，85℃ 5min，37℃ 20min，產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：50℃預(yù)變性2min，95℃變性10min，1個循環(huán)；95℃退火15s，60℃延伸60s，40個循環(huán)。根據(jù)參考文獻(xiàn)，采用2-△△Ct法表示相對定量結(jié)果[4]。

6.蛋白印跡法：藥物干預(yù)48h后，以蛋白裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白定量。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜(0.22μm，88024，美國Pierce公司)上，室溫下脫色搖床上封閉1h。Anti-MMP2 鼠抗體(1∶500)、Anti-MMP9 鼠抗體(1∶500)、Anti-VEGF 鼠抗體(1∶200)，4℃孵育過夜，次日以兔抗小鼠 IgG(H+L)二抗(1∶5000，中國Beyotime公司)室溫孵育2h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemil-uminescene，ECL)進(jìn)行顯影。

結(jié) 果

1.不同濃度去甲腎上腺素對HT-29細(xì)胞增殖能力的影響：CCK-8增殖實驗結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞活力呈上升趨勢。當(dāng)分別加入0.1、1、10及100μmol/L去甲腎上腺素時，隨著濃度增加先呈上升趨勢，后又下降，同時100μmol/L去甲腎上腺素可明顯抑制細(xì)胞生長，故選擇10μmol/L去甲腎上腺素處理48h進(jìn)行后期實驗(圖1)。

圖1 不同濃度去甲腎上腺素對HT-29細(xì)胞增殖能力的影響A.對照組；B.0.1μmol/L去甲腎上腺素組；C.1μmol/L去甲腎上腺素組;D.10μmol/L去甲腎上腺素組；E.100μmol/L去甲腎上腺素組

2.去甲腎上腺素通過β-AR信號通路對細(xì)胞侵襲能力的影響：Transwell侵襲實驗顯示，隨著去甲腎上腺素濃度的增加，HT-29細(xì)胞侵襲能力逐漸增強(qiáng)。與空白對照組比較，0.1、1、10μmol/L去甲腎上腺素組HT-29細(xì)胞遷移率分別為144.60%±0.58%、215.80%±29.15%、253.00%±16.78%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時將10nmol/L普萘洛爾作用于HT-29細(xì)胞。10nmol/L普萘洛爾組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而10nmol/L普萘洛爾聯(lián)合10μmol/L去甲腎上腺素組與10μmol/L去甲腎上腺素組比較，Transwell小室下層細(xì)胞數(shù)顯著減少(P=0.016)，提示普萘洛爾可逆轉(zhuǎn)NE對HT-29的促侵襲作用(圖2)。

圖2 不同藥物處理組對HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫，×200)A.對照組；B.0.1μmol/L去甲腎上腺素組；C.1μmol/L去甲腎上腺素組;D.10μmol/L去甲腎上腺素組；E.10nmol/L普萘洛爾組；F.10μmol/L去甲腎上腺素+ 10nmol/L普萘洛爾組;與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與10μmol/L去甲腎上腺素組比較，#P<0.05

3.去甲腎上腺素通過β-AR信號通路對HT-29細(xì)胞MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA表達(dá)的影響：根據(jù)Transwell侵襲結(jié)果，將10μmol/L去甲腎上腺素作用于HT-29細(xì)胞24h后，通過qRT-PCR檢測細(xì)胞MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA表達(dá)水平。與對照組比較，10μmol/L去甲腎上腺能上調(diào)HT-29細(xì)胞中MMP-2(P=0.051)、MMP-9(P=0.002)和VEGF (P=0.026)mRNA表達(dá)水平，其中MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而普萘洛爾聯(lián)合去甲腎上腺素組與去甲腎上腺素組比較，MMP-2(P=0.041)、MMP-9(P=0.002)和VEGF(P=0.023)mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3 不同藥物對HT-29細(xì)胞MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達(dá)的影響A.對照組；B.10nmol/L普萘洛爾組；C.10μmol/L去甲腎上腺素組；D.10μmol/L去甲腎上腺素+10nmol/L普萘洛爾組；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與10μmol/L去甲腎上腺素組比較，#P<0.05，##P<0.01

4.去甲腎上腺素通過β-AR信號通路對MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)的影響：采用Western blot法檢測去甲腎上腺素對MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)的影響，與對照組比較，10μmol/L去甲腎上腺素作用HT-29細(xì)胞24h后MMP-2(P=0.033)、MMP-9(P=0.004)和VEGF(P=0.002)蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而10nmol/L普萘洛爾聯(lián)合去甲腎上腺素組與去甲腎上腺素組比較，MMP-9(P=0.015)和VEGF(P=0.004)的蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

圖4 不同藥物對HT-29細(xì)胞MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)的影響A.對照組；B.10nmol/L普萘洛爾組；C.10μmol/L去甲腎上腺素組；D.10μmol/L去甲腎上腺素+10nmol/L普萘洛爾組；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與10μmol/L去甲腎上腺素組比較，#P<0.05，##P<0.01

5.去甲腎上腺素通過β-AR信號通路對HT-29細(xì)胞ERK1/2及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響：采用Western blot法檢測10μmol/L去甲腎上腺素對HT-29細(xì)胞ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。與對照組比較，普萘洛爾作用細(xì)胞24h后，ERK1/2和p-ERK1/2蛋白均無明顯變化，而10μmol/L去甲腎上腺素組細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增高(P=0.002)。將10nmol/L普萘洛爾與10μmol/L去甲腎上腺素共同作用于HT-29細(xì)胞后，p-ERK1/2蛋白表達(dá)較去甲腎上腺素組顯著降低(P=0.012)，提示普萘洛爾可減弱NE對HT-29細(xì)胞ERK1/2活性影響的作用(圖5)。

圖5 不同藥物對HT-29細(xì)胞ERK1/2和pERK1/2蛋白表達(dá)的影響A.對照組；B.10nmol/L普萘洛爾組；C.10μmol/L去甲腎上腺素組；D.10μmol/L去甲腎上腺素+10nmol/L普萘洛爾組;與對照組比較，*P<0.01；與10μmol/L去甲腎上腺素組比較，#P<0.05

討 論

由于免疫系統(tǒng)對于調(diào)節(jié)實體腫瘤生長的不確定性，交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放的應(yīng)激激素能否直接影響到腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移潛能是近年來研究的熱點。大量研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的各階段中，機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生增多的神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)能夠使腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生改變[5]。人體交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放的神經(jīng)遞質(zhì)主要為去甲腎上腺素，通過作用于α-AR和β-AR而發(fā)揮調(diào)控作用，研究表明，β-AR信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。去甲腎上腺素與腫瘤細(xì)胞表面的β-AR結(jié)合，繼而活化Ga蛋白介導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)，AC將三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，cAMP通過下游效應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞活動。由于腫瘤類型和腎上腺素能受體亞型的不同，應(yīng)激激素在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的同時，也出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象。如β-AR信號通路激活能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[7,8]。但采用吡布特羅激活β2-AR信號通路后，由于阻斷了Raf-1/Mek-1/Erk1/2信號通路，則抑制了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，鑒于吡布特羅可以直接阻斷Raf-1/Mek-1/Erk1/2信號通路，同時多數(shù)研究認(rèn)為兒茶酚胺類抑制腫瘤增殖的機(jī)制大多是通過作用于細(xì)胞的α-AR或多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白[9,10]。因此，兒茶酚胺類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用是否通過β-AR信號通路實現(xiàn)目前仍存在爭議。

研究發(fā)現(xiàn)，P物質(zhì)、多巴胺及去甲腎上腺素能夠提高乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，其中去甲腎上腺素對乳腺癌細(xì)胞的移動具有趨化作用，并且能促進(jìn)肺癌及前列腺癌細(xì)胞的遷移，而β-AR阻斷劑能阻斷這種促進(jìn)作用[11～14]。本研究首先采用0、0.1、1、10μmol/L濃度的去甲腎上腺素作用于HT-29細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞體外侵襲能力的影響。隨著去甲腎上腺素濃度的提高，HT-29細(xì)胞侵襲能力逐漸增強(qiáng)。根據(jù)既往研究提示，兒茶酚胺類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用主要是通過激活β-AR信號通路來實現(xiàn)的[6]。進(jìn)一步采用非選擇性β-AR阻斷劑普萘洛爾對HT-29細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后再與去甲腎上腺素共同作用于HT-29細(xì)胞，觀察細(xì)胞侵襲能力的變化。普萘洛爾能明顯拮抗去甲腎上腺素對HT-29細(xì)胞體外侵襲能力的促進(jìn)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，兒茶酚胺類物質(zhì)通過上調(diào)MMPs和VEGF的水平，提高口腔、前列腺、胰腺等惡性腫瘤細(xì)胞的血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移能力[15～17]。腫瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)作為一類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)活性的酶家族，在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵的作用。其中，MMP-9作為家族中分子量最大的成員，通過降解ECM和基膜，使腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤，同時通過促進(jìn)新生血管的形成，從而加速腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。VEGF則是腫瘤新生血管形成的重要調(diào)控因子，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3和SKOV3釋放VEGF，提示VEGF和MMPs之間的相互作用可能在卵巢癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。此外，在研究人頭頸部腫瘤細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，MMP-9與VEGF的水平呈正相關(guān)，并且與血管生成密切相關(guān)。在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中同樣觀察到，VEGF水平與MT1-MMP、MMP-2和MMP-9均呈正相關(guān)。而MT1-MMP是激活MMP-2的重要組織因子，因此也提示MMPs具有調(diào)控VEGF的表達(dá)及生物學(xué)活性的作用。

隨著研究深入，β-AR信號通路被發(fā)現(xiàn)在兒茶酚胺類物質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程中扮演著橋梁作用[18,19]。本研究中qRT-PCR及Western blot法檢測結(jié)果均證實，去甲腎上腺素作用于HT-29細(xì)胞48h后，MMP-2、MMP-9及VEGF的表達(dá)均有顯著上調(diào)。將普萘洛爾阻斷β-AR信號通路后能逆轉(zhuǎn)去甲腎上腺素上調(diào)HT-29細(xì)胞MMP-9及VEGF 表達(dá)作用。本實驗同時檢測了去甲腎上腺素對ERK1/2信號通路的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素作用于HT-29細(xì)胞后，與對照組比較p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增高，而普萘洛爾能拮抗去甲腎上腺素的作用，減弱其對ERK1/2活性的影響。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員之一，以非磷酸化和磷酸化兩種形態(tài)存在于細(xì)胞中。其中，磷酸化ERK(phospho-ERK，p-ERK)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演重要的角色。p-ERK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，作用于核因子-κB、Ets、Sp1等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)MMPs的轉(zhuǎn)錄與活化和腫瘤新生血管的形成，提高腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[20,21]。本研究內(nèi)容較為基礎(chǔ)，后續(xù)將進(jìn)一步通過動物實驗或臨床實驗予以完善。

綜上所述，本研究提示去甲腎上腺素通過β-AR信號通路，上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)及ERK1/2的活性，進(jìn)而提高HT-29細(xì)胞的體外侵襲能力。