基于高光譜技術(shù)的菌落圖像分割與計(jì)數(shù)

李艷肖，胡雪桃，張 芳，石吉勇※，邱白晶

基于高光譜技術(shù)的菌落圖像分割與計(jì)數(shù)

李艷肖1，胡雪桃1，張 芳2，石吉勇2※，邱白晶1

（1. 江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

在平板菌落計(jì)數(shù)過(guò)程中，菌落與背景區(qū)域類(lèi)似的顏色會(huì)干擾菌落的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。為了準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌數(shù)，該研究利用高光譜圖像技術(shù)捕捉成分差異引起的菌落與背景區(qū)域光譜特征，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)平板的菌落進(jìn)行分割并實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)。采集枯草芽孢桿菌菌落平板的高光譜圖像，提取菌落、背景區(qū)域的高光譜信息；利用遺傳算法結(jié)合最小二乘支持向量機(jī)建立菌落區(qū)域/背景區(qū)域判別模型；隨后，將菌落平板高光譜圖像中每一個(gè)像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的光譜信息代入判別模型以判斷屬于菌落的區(qū)域，模型的識(shí)別率為97.22%；最后，利用特征波段下的高光譜圖像實(shí)現(xiàn)菌落的分割及計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)平均相對(duì)誤差值為4.2 %，用時(shí)約為10 min。相比較于計(jì)算機(jī)視覺(jué)計(jì)數(shù)法，菌落計(jì)數(shù)法的平均相對(duì)誤差降低了49.4%，結(jié)果表明建立的方法有望成為一類(lèi)新的準(zhǔn)確平板菌落計(jì)數(shù)方法。

圖像分割；遺傳算法；最小二乘支持向量機(jī)；高光譜圖像技術(shù)；平板菌落計(jì)數(shù)；化學(xué)計(jì)量學(xué)；枯草芽孢桿菌

0 引 言

平板菌落計(jì)數(shù)法可測(cè)定食品、農(nóng)產(chǎn)品的活體微生物數(shù)量，是有效評(píng)價(jià)食品微生物學(xué)安全性的國(guó)標(biāo)方法[1]。該方法將食品樣品制成包含活體微生物的稀釋液并置于無(wú)菌的瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)活體微生物均可借助吸收瓊脂中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷繁殖形成菌落，依據(jù)菌落與背景（瓊脂培養(yǎng)基）的顏色差異對(duì)菌落進(jìn)行分割并實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)[2-3]。

現(xiàn)有的平板菌落計(jì)數(shù)方式可分為人工視覺(jué)法和計(jì)算機(jī)視覺(jué)法兩大類(lèi)。人工視覺(jué)法利用肉眼（必要時(shí)借助放大鏡）感知菌落與背景的顏色差異來(lái)分割、識(shí)別平板中的菌落，借助記號(hào)筆或菌落計(jì)數(shù)器實(shí)現(xiàn)平板中菌落的計(jì)數(shù)[4-5]。人工視覺(jué)法具有結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但是用眼強(qiáng)度大、菌落識(shí)別具有一定的主觀(guān)性[6]，難以實(shí)現(xiàn)大量樣本的快速計(jì)數(shù)。計(jì)算機(jī)視覺(jué)法利用相機(jī)獲取菌落與背景圖像信息，利用圖像處理算法捕捉菌落與背景的顏色差異特征，可自動(dòng)分割平板中的菌落并實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)[7-8]。在計(jì)算機(jī)視覺(jué)法基礎(chǔ)上發(fā)展了全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，可實(shí)現(xiàn)菌落的自動(dòng)計(jì)數(shù)[9]。建立的檢測(cè)方法具有客觀(guān)、速度快的優(yōu)勢(shì)[10]，但菌落與背景顏色接近時(shí)圖像處理算法分割菌落的能力下降[11]，導(dǎo)致菌落的計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)誤差。衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫部門(mén)的實(shí)踐操作表明，當(dāng)菌落與背景區(qū)域的顏色非常接近時(shí)，不僅計(jì)算機(jī)視覺(jué)法難以有效分割菌落，甚至人工視覺(jué)也經(jīng)常發(fā)生誤判[12]。為了提高菌落計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度，學(xué)者提出了瓊脂培養(yǎng)基中添加菌落著色劑氯化三苯甲基四氮唑（Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC）的研究思路，研究結(jié)果表明TTC的加入可以增大菌落與背景區(qū)域的顏色差異[13-14]，從而提高菌落分割的準(zhǔn)確度。但相關(guān)研究已證實(shí)TTC會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)[4]，加入TTC與提高菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度的初衷背道而馳。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)引起菌落與背景產(chǎn)生顏色差異的根本原因在于二者的化學(xué)成分不一致[15]，因此擬從表征菌落區(qū)域與背景區(qū)域的成分存在差異這一角度出發(fā)，借助高光譜圖像數(shù)據(jù)包含像素點(diǎn)光譜信息的優(yōu)勢(shì)[16]，利用高光譜圖像技術(shù)捕捉菌落及背景區(qū)域因成分差異引起的光譜特征，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量法對(duì)平板中的菌落進(jìn)行分割及計(jì)數(shù)，期望得到一類(lèi)新的平板菌落計(jì)數(shù)法，為食品、農(nóng)產(chǎn)品的微生物準(zhǔn)確檢測(cè)提供切實(shí)有效的方法。

1 材料與方法

1.1 樣品的制備

將保藏于冰箱的枯草芽孢桿菌（）接種到LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，鏡檢無(wú)雜菌后，用無(wú)菌水以10-2、10-3、10-4梯度稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基上[17]，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出立即進(jìn)行高光譜圖像采集和菌落計(jì)數(shù)。為保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。

LB液體培養(yǎng)基配方為：無(wú)菌水1 000 mL，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，氯化鈉10.0 g；LB固體培養(yǎng)基配方為：無(wú)菌水1 000 mL，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，瓊脂粉20.0 g，氯化鈉10.0 g。2種培養(yǎng)基用5 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.0，在210 ℃高壓下蒸汽滅菌21 min。

1.2 高光譜圖像采集和光譜信息獲取

高光譜圖像采集系統(tǒng)如圖1所示[18]，主要由波長(zhǎng)范圍為400～1 000 nm、光譜分辨率為2.8 nm的圖像光譜儀（V10E型，芬蘭ImSpector公司）和CCD攝像頭（Clara，英國(guó)Andor公司）、150 W光纖鹵素?zé)簦‵iber-Lter DC950 型，美國(guó)DolanJenner公司）、精密電控平移臺(tái)（SC30021 A型，中國(guó)Zolix公司）和計(jì)算機(jī)等部件組成。高光譜圖像數(shù)據(jù)采集之前，需打開(kāi)系統(tǒng)預(yù)熱30 min以上，預(yù)熱后設(shè)置高光譜系統(tǒng)采集的相關(guān)參數(shù)如電控平臺(tái)速度、相機(jī)曝光時(shí)間等；數(shù)據(jù)采集完成后，對(duì)采集到的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行黑白校正；其中試驗(yàn)參數(shù)設(shè)定、采集步驟及校正具體步驟參照Z(yǔ)hu等人建立的方法[19]。

圖1 高光譜圖像采集系統(tǒng)

本文使用ENVI軟件從36個(gè)菌落平板高光譜圖像中提取36條菌落光譜、36條培養(yǎng)基光譜和36條培養(yǎng)皿邊緣的高光譜信息。首先在每個(gè)平板菌落圖像中隨機(jī)選擇5個(gè)菌落感興趣區(qū)域（大小為1×1像素的正方形），然后提取每個(gè)感興趣區(qū)域內(nèi)光譜信息，最后將5個(gè)區(qū)域的光譜取平均值，得到對(duì)應(yīng)的1條原始光譜，通過(guò)處理36個(gè)平板，共得到36條菌落光譜。同理，采集得到36條培養(yǎng)基光譜和36條培養(yǎng)皿邊緣光譜，共采集108條原始光譜。每條光譜數(shù)據(jù)包含618個(gè)波長(zhǎng)下光譜信息，最終得到大小為108×618的原始光譜數(shù)據(jù)集，其中，108為數(shù)據(jù)的個(gè)數(shù)，即樣本數(shù)，618為每個(gè)數(shù)據(jù)包含的變量數(shù)。

1.3 菌落分割模型的建立

為了消除高光譜圖像采集中高頻隨機(jī)噪聲、基線(xiàn)漂移、樣本表面粗糙和光散射等帶來(lái)的不良影響，首先必須對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿邊緣和菌落的原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（Standard Normal Variate Transformation，SNV）預(yù)處理可以使分散的光譜曲線(xiàn)集中，有效實(shí)現(xiàn)對(duì)基線(xiàn)的校正，減少樣本信號(hào)噪聲，提高信號(hào)的分辨率和靈敏度[20-21]。

為了初步探索菌落與非菌落之間光譜的差異性，研究利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）對(duì)光譜進(jìn)行聚類(lèi)分析。根據(jù)物質(zhì)內(nèi)部基團(tuán)對(duì)光能的吸收具有選擇性可知，并不是所有波長(zhǎng)下的光譜都同物質(zhì)內(nèi)部成分高度相關(guān)，故需要對(duì)高光譜信息進(jìn)行特征篩選。遺傳算法（Genetic Algorithms，GA）通過(guò)選擇、交換、突變等遺傳算子，隨著不斷的遺傳迭代，淘汰掉較差的變量，保留目標(biāo)函數(shù)值較優(yōu)的變量，最終篩選出特征光譜信息用于建模[22]。本文采用偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）的交叉驗(yàn)證均方根誤差（Root Mean Square Error Cross Validation，RMSECV）作為評(píng)價(jià)個(gè)體波長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的依據(jù)，用來(lái)判斷種群個(gè)體的優(yōu)劣程度。

本文利用GA選擇的特征變量建立GA-LS-SVM模型，用于菌落平板的菌落、培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿邊緣的識(shí)別。最小二乘支持向量機(jī)（Least Square Support Vector Machine，LS-SVM）可以將多維的特征輸入映射到高維的核空間，使原來(lái)不可分的數(shù)據(jù)獲得新的特征后進(jìn)行分類(lèi)，很好地解決非線(xiàn)性分類(lèi)問(wèn)題[19]。試驗(yàn)采集了108條光譜（培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿邊緣和菌落的樣本光譜數(shù)都為36條），通過(guò)隨機(jī)分組將72條光譜作為校正集，余下的36條作為預(yù)測(cè)集。模型的優(yōu)劣以模型識(shí)別率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，模型識(shí)別率為菌落正確識(shí)別的概率，即正確識(shí)別的菌落數(shù)量/菌落總數(shù)。根據(jù)菌落區(qū)域和背景區(qū)域因成分差異引起的特征光譜建立其GA-LS-SVM判別模型，再利用該判別模型對(duì)高光譜圖像中每一像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的光譜信息進(jìn)行判別，識(shí)別高光譜圖像中菌落區(qū)域和背景區(qū)域。

1.4 菌落計(jì)數(shù)

平板菌落計(jì)數(shù)的主要步驟分為高光譜圖像的獲取、菌落的分割、粘連菌落的分割以及菌落數(shù)的計(jì)算。高光譜圖像的獲取參照1.2節(jié)。獲取樣品的高光譜圖像后，將每個(gè)像素點(diǎn)的光譜信息代入菌落分割GA-LS-SVM模型中。當(dāng)該像素點(diǎn)被識(shí)別為背景時(shí)，將該像素點(diǎn)的灰度值設(shè)為0，當(dāng)該像素點(diǎn)被識(shí)別為菌落時(shí)，將像素點(diǎn)的灰度值設(shè)為1。經(jīng)過(guò)上述步驟后，得到菌落分割二值圖，實(shí)現(xiàn)待測(cè)培養(yǎng)平板高光譜圖像中菌落區(qū)域的判別和分割。

采用灰度閾值分割方法對(duì)特征波段下的高光譜菌落割圖像進(jìn)行粘連菌落的分割，得到粘連菌落分割二值圖，菌落區(qū)域的灰度值為1，非菌落區(qū)域的灰度值為0。結(jié)合菌落分割二值圖和粘連菌落分割二值圖，若2張圖片的中像素點(diǎn)的灰度值都為1時(shí)，則該像素點(diǎn)的灰度值記為1，此時(shí)該像素點(diǎn)為菌落區(qū)域。若2張圖中像素點(diǎn)的灰度值不全為1時(shí)，該像素點(diǎn)的灰度值記為0，此時(shí)該像素點(diǎn)為背景區(qū)域。由此得到了最終菌落計(jì)數(shù)圖。

采用局部鄰域算法中的輪廓跟蹤算法對(duì)分割出的菌落最終計(jì)數(shù)圖進(jìn)行計(jì)數(shù)[18,23]，對(duì)圖像進(jìn)行掃描將此次標(biāo)號(hào)改為其八連通域內(nèi)的最小標(biāo)號(hào)，重復(fù)執(zhí)行此過(guò)程到不需要做標(biāo)號(hào)標(biāo)記為止。最終實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)平板中的枯草芽孢桿菌菌落計(jì)數(shù)。

為了評(píng)價(jià)建立的計(jì)數(shù)方法的可重復(fù)性，對(duì)7個(gè)菌落平板進(jìn)行了菌落計(jì)數(shù)。為了驗(yàn)證建立方法的準(zhǔn)確性，利用人工視覺(jué)計(jì)數(shù)和計(jì)算機(jī)視覺(jué)計(jì)數(shù)驗(yàn)證[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高光譜信息與圖像信息的分析

高光譜圖像技術(shù)采集到的光譜信息主要呈現(xiàn)的是物質(zhì)內(nèi)部化學(xué)基團(tuán)合頻和倍頻吸收情況[24]，而菌落和背景區(qū)域內(nèi)部化學(xué)組分差異會(huì)引起光譜響應(yīng)值的差異。枯草芽孢桿菌菌落、LB固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿邊緣的感興趣區(qū)域及3種物質(zhì)的平均光譜曲線(xiàn)如圖2a所示，光譜曲線(xiàn)的波長(zhǎng)范圍為431～963 nm，3種物質(zhì)的光譜曲線(xiàn)形狀及反射率值都存在很大的差異。利用3種物質(zhì)的特征光譜曲線(xiàn)，可以實(shí)現(xiàn)它們的準(zhǔn)確區(qū)分。本文通過(guò)對(duì)菌落和背景區(qū)域的光譜信息進(jìn)行主成分分析，來(lái)初步探索菌落和背景的光譜差異性。主成分分析可以在不降低光譜差異性的前提下，對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，將得到的主成分?jǐn)?shù)據(jù)特征用散點(diǎn)圖表示，每一散點(diǎn)代表1條光譜（圖2b）[25]。由圖2b的菌落與背景二維主成分分析圖可以看出，利用第1主成分（the first Principal Component Analysis，PC1）和第2主成分（PC2）可以明顯的區(qū)分菌落和背景區(qū)域，有良好的聚類(lèi)趨勢(shì)。PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為81.05%和4.16%。以上結(jié)果表明利用高光譜信息可以對(duì)菌落與背景進(jìn)行定性分類(lèi)。

圖2 原始光譜曲線(xiàn)及其主成分分析圖

2.2 光譜的預(yù)處理

本試驗(yàn)首先采用SNV方法對(duì)校正集原始光譜（24條菌落區(qū)域光譜、48條背景區(qū)域的光譜）進(jìn)行處理，在后續(xù)試驗(yàn)中，選用SNV預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和建模。在數(shù)據(jù)建模過(guò)程中，輸入的變量越少，建立的模型越穩(wěn)定性，魯棒性越好。因此本試驗(yàn)采用GA進(jìn)行特征波長(zhǎng)篩選，以便簡(jiǎn)化變量信息，在不損失有用光譜信息的前提下，最大程度地減少變量數(shù)。按照GA的取值規(guī)律，設(shè)定控制參數(shù)種群大小為108、遺傳迭代次數(shù)為200、染色體個(gè)數(shù)為50、基因交換概率為0.95、基因變異概率為0.01，來(lái)優(yōu)化遺傳算法。通過(guò)該優(yōu)化的遺傳算法，最終從全波段中篩選出能表征菌落和背景的11個(gè)特征波長(zhǎng)，分別為604、636、790、799、748、683、492、437、558、470和928 nm。所篩選出的特征波長(zhǎng)主要與枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程分泌大量揮發(fā)性脂肪和胞外酶如蛋白酶、乙酸及丁酸等代謝物及培養(yǎng)基成分等中含氫基團(tuán)C-H、O-H合頻和倍頻吸收有關(guān)。

2.3 菌落的分割

經(jīng)GA特征波長(zhǎng)篩選后，模型自變量由全波段光譜數(shù)據(jù)的618個(gè)降至11個(gè)。將菌落區(qū)域和背景區(qū)域?qū)?yīng)11個(gè)特征波長(zhǎng)下的光譜信息作為輸入變量，光譜種類(lèi)（菌落或背景區(qū)域）為輸出變量，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法GA-LS-SVM確立光譜信息和光譜種類(lèi)的關(guān)系，得到菌落的判別模型GA-LS-SVM。LS-SVM建模過(guò)程中選擇徑向基函數(shù)（Radial Basis Function，RBF）為核函數(shù)，采用交叉驗(yàn)證法與網(wǎng)格搜索法對(duì)RBF核參數(shù)的參數(shù)即正則化參數(shù)和對(duì)核參數(shù)2參數(shù)進(jìn)行尋優(yōu)計(jì)算，尋優(yōu)過(guò)程由粗選和精選2個(gè)步驟組成[26]：粗選格點(diǎn)數(shù)10×10，搜索步長(zhǎng)較大；精選格點(diǎn)數(shù)仍為10×10，在粗選基礎(chǔ)上，以較小步長(zhǎng)更加細(xì)致地搜索，以定標(biāo)集交互驗(yàn)證均方根誤差（Root Mean Square Error of Cross Validation，RMSECV）最小為指標(biāo)，確定最優(yōu)的（，2）組合。本文設(shè)定10-2～102為參數(shù)的范圍進(jìn)行網(wǎng)格搜索。經(jīng)處理得到模型最佳參數(shù)組合為2=78.48，=1 311.004，此時(shí)GA-LS-SVM模型預(yù)測(cè)集的正確識(shí)別率為97.22%（RMSECV最小值為0.488）。同時(shí)，利用全波長(zhǎng)的光譜信息建立的LS-SVM模型預(yù)測(cè)集的正確識(shí)別率為94.44%。結(jié)果說(shuō)明GA篩選出的11個(gè)特征波長(zhǎng)包括菌落和背景區(qū)域的大部分光譜信息，可以利用該判別模型進(jìn)行后續(xù)菌落的分割。

把菌落和背景區(qū)域在全變量下的高光譜圖像（圖3a）簡(jiǎn)化為在特征波長(zhǎng)下的圖像，逐一提取特征波長(zhǎng)下待測(cè)培養(yǎng)平板中的高光譜圖像中每一像素點(diǎn)的高光譜信息，代入上述已建的GA-LS-SVM判別模型，對(duì)菌落平板中的每一像素點(diǎn)進(jìn)行判別。當(dāng)像素點(diǎn)灰度值為1時(shí)，像素點(diǎn)處被判別為菌落，同時(shí)，當(dāng)像素點(diǎn)灰度值為0時(shí)，表明該位置為背景區(qū)域，最終實(shí)現(xiàn)待測(cè)培養(yǎng)平板高光譜圖像中菌落的判別和分割。由于高光譜圖像技術(shù)采集圖像信息時(shí)易受儀器及環(huán)境噪聲的影響，使得分割后的菌落區(qū)域圖像有少量雜散噪聲點(diǎn)[6]。可根據(jù)先驗(yàn)知識(shí)，人機(jī)交互設(shè)定1個(gè)閾值，統(tǒng)計(jì)噪聲點(diǎn)連通區(qū)域的面積，如面積小于設(shè)定的閾值，則認(rèn)為是噪聲點(diǎn)，不予計(jì)數(shù)[18]。經(jīng)檢測(cè)本試驗(yàn)菌落圖像上噪聲點(diǎn)像素面積小于6而菌落的像素點(diǎn)面積超過(guò)16，因此設(shè)定閾值為6可去除噪聲點(diǎn)的干擾。得到菌落圖像分割二值圖（圖3b）。圖3b是利用菌落識(shí)別方法對(duì)平板的菌落進(jìn)行了分割，此時(shí)只是將菌落從背景中分離出來(lái)，有些菌落之間存在明顯的粘連，粘連菌落的存在往往導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果小于實(shí)際的菌落數(shù)，利用此圖無(wú)法對(duì)準(zhǔn)確計(jì)算菌落數(shù)量。因此有必要對(duì)粘連的菌落進(jìn)行分割并計(jì)數(shù)。

圖3 高光譜圖像菌落分割結(jié)果

2.4 粘連菌落的分割

針對(duì)特征波長(zhǎng)下高光譜圖像中粘連菌落不同部位的像素點(diǎn)灰度值存在較大差異的特點(diǎn)，本文提出采用灰度閾值分割方法實(shí)現(xiàn)粘連菌落的分割[26]。對(duì)貢獻(xiàn)率最大的波長(zhǎng)（604 nm）圖像進(jìn)行粘連菌落處理，來(lái)實(shí)現(xiàn)粘連菌落的分割，得到了粘連菌落分割二值圖。具體的操作過(guò)程為：從枯草芽孢桿菌在604 nm下的高光譜圖像的偽彩色圖（圖4a）可以看出，單一菌落顏色從中心到邊緣依次呈紅色、黃色、天藍(lán)色以及藍(lán)色且呈圓圈型變化。對(duì)圖4a進(jìn)行三維圖形等高線(xiàn)處理，以像素點(diǎn)顏色灰度表示等高線(xiàn)的大小（圖4b），并放大粘連菌落的三維圖形（圖4c）。根據(jù)顏色標(biāo)尺，每個(gè)菌落中心點(diǎn)到邊緣的灰度值由0.8逐漸減小為0.3。對(duì)于粘連菌落，粘連菌落有2個(gè)中心點(diǎn)，2個(gè)中心呈紅色，由中心向邊緣延伸時(shí)，粘連菌落還有黃色（灰度值約為0.5～0.6）和天藍(lán)色（灰度值約為0.4～0.5）。圖4c可觀(guān)察到粘連菌落有2個(gè)明顯的峰，頂部的顏色仍為紅色，菌落粘連處不僅有黃色（灰度值高于0.5），還有天藍(lán)色（灰度值低于0.5）。這說(shuō)明該高光譜圖像粘連菌落區(qū)域的顏色特征和非粘連區(qū)域的顏色特征不同，2個(gè)菌落并未完全合并。因此將菌落粘連處的天藍(lán)色區(qū)域作為分割區(qū)域，將分割閾值設(shè)為0.5，分割后的粘連菌落如圖4d所示。

圖4 利用604 nm下的高光譜圖像特征分割粘連菌落的結(jié)果

經(jīng)過(guò)菌落分割和粘連菌落分割等步驟，得到最終菌落計(jì)數(shù)圖（圖5），實(shí)現(xiàn)了菌落的準(zhǔn)確分割。

圖5 最終菌落計(jì)數(shù)圖

2.5 菌落計(jì)數(shù)

采用局部鄰域算法中的輪廓跟蹤算法對(duì)分割出的菌落最終計(jì)數(shù)圖進(jìn)行計(jì)數(shù)[27]，最終實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)平板中的枯草芽孢桿菌菌落計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果為48（圖5）。

枯草芽孢桿菌菌落形態(tài)呈圓形，其邊緣光滑，顏色為淺黃色，本研究培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌落與典型菌落形態(tài)描述一致（圖6a）。針對(duì)本試驗(yàn)枯草芽孢桿菌菌落的彩色圖像特點(diǎn)，本文分別采用人工視覺(jué)和計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)平板中的枯草芽孢桿菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用人工視覺(jué)計(jì)數(shù)法計(jì)算的枯草芽孢桿菌菌落數(shù)為46（圖6a）。采用灰度閾值分割算法對(duì)菌落平板彩色圖像（圖6a）進(jìn)行二值化處理，結(jié)果如圖6b所示。從圖6b可以看出，閾值分割法使一部分背景點(diǎn)錯(cuò)分為菌落，特別是右上邊部分，菌落和背景連在一起，不利于后續(xù)的計(jì)數(shù)。再對(duì)圖6b進(jìn)行處理，以便去除培養(yǎng)皿邊緣和分割粘連菌落等的影響，最終得到菌落圖像分割圖，如圖6c所示。從圖6c清晰地可以看到有粘連菌落沒(méi)能被成功分割開(kāi)，有些菌落被分割成背景等，計(jì)算機(jī)視覺(jué)計(jì)數(shù)法計(jì)算該平板中菌落數(shù)為44（圖6c）。

注：圖b的橢圓區(qū)域?yàn)槠桨灞尘包c(diǎn)錯(cuò)分為菌落的區(qū)域，圖c的橢圓區(qū)域?yàn)闆](méi)能被成功分割開(kāi)的粘連菌落區(qū)域。

利用提出的基于高光譜技術(shù)的平板菌落計(jì)數(shù)方法、基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)的平板菌落計(jì)數(shù)方法和人工視覺(jué)計(jì)數(shù)法（國(guó)標(biāo)法）分別對(duì)同一培養(yǎng)平板中枯草芽孢桿菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果依次為48、44和46。為了驗(yàn)證建立方法的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性，研究對(duì)7個(gè)菌落平板進(jìn)行檢測(cè)。將人工視覺(jué)計(jì)數(shù)方法作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，高光譜圖像計(jì)數(shù)法的平均相對(duì)誤差值為4.2%，優(yōu)于計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果（平均相對(duì)誤差值為8.3%），具體結(jié)果如表1所示。全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀是在計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的，主要利用圖像處理算法捕捉菌落與背景的顏色差異特征，自動(dòng)分割平板中的菌落，從而實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)，自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)的時(shí)間一般少于5 min，檢測(cè)結(jié)果精度與計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)一致。對(duì)于本研究建立的方法，檢測(cè)平板菌落數(shù)的步驟主要包括高光譜圖像的獲取、菌落分割、粘連菌落分割和菌落數(shù)計(jì)算，耗費(fèi)的時(shí)間分別為4、2、2和2 min，總耗時(shí)約為10 min。比自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)耗時(shí)長(zhǎng)。但是其準(zhǔn)確度卻大大提高，平均相對(duì)誤差降低了49.4%，結(jié)果表明，建立的計(jì)數(shù)方法有利于食品、農(nóng)產(chǎn)品中菌落數(shù)的準(zhǔn)確檢測(cè)。

表1 3種計(jì)數(shù)方法的檢測(cè)結(jié)果

本研究以枯草芽孢桿菌菌落平板為實(shí)例，詳細(xì)介紹了基于高光譜技術(shù)的平板菌落計(jì)數(shù)方法，建立的方法只能用于實(shí)際樣品中枯草芽孢桿菌的菌落計(jì)數(shù)。若要檢測(cè)其他菌株菌落數(shù)，需要重新建立適用于目標(biāo)菌株的計(jì)數(shù)方法，具體的方法可以參考本研究建立計(jì)數(shù)法的步驟?；旌暇昃淦桨逵?jì)數(shù)是當(dāng)前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，當(dāng)不能根據(jù)菌落形貌肉眼區(qū)別菌株類(lèi)別時(shí)，利用人工視覺(jué)計(jì)數(shù)和計(jì)算機(jī)視覺(jué)計(jì)數(shù)法無(wú)法實(shí)現(xiàn)混合菌株平板中每種菌株菌落的計(jì)數(shù)。不同菌株菌落具有不同高光譜圖像信息，因此將高光譜圖像技術(shù)和菌落平板計(jì)數(shù)法結(jié)合對(duì)混合菌落平板進(jìn)行計(jì)數(shù)是課題組接下來(lái)的研究目標(biāo)。

3 結(jié) 論

本文利用高光譜圖像技術(shù)捕捉菌落與背景區(qū)域因成分差異引起的光譜特征，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量法方法對(duì)平板中的菌落進(jìn)行分割并實(shí)現(xiàn)了計(jì)數(shù)。主要結(jié)論如下：

1）利用遺傳算法（Genetic Algorithms，GA）結(jié)合最小二乘支持向量機(jī)（Least Square Support Vector Machine，LS-SVM）建立了菌落區(qū)域和背景區(qū)域的判別模型，模型識(shí)別率為97.22%。

2）利用已建GA-LS-SVM判別模型實(shí)現(xiàn)了菌落與背景的分割，利用特征波段604 nm下的高光譜圖像實(shí)現(xiàn)了粘連菌落之間的分割，最終建立了基于高光譜技術(shù)的菌落計(jì)數(shù)方法。建立的菌落計(jì)數(shù)法平均相對(duì)誤差為4.2%，低于計(jì)算機(jī)視覺(jué)法的平均相對(duì)誤差（8.3%）。

3）建立的菌落計(jì)數(shù)法耗時(shí)約10 min，表明提出的菌落計(jì)數(shù)方法的有望成為一種新的平板菌落計(jì)數(shù)方法，為食品、農(nóng)產(chǎn)品中微生物數(shù)量的準(zhǔn)確檢測(cè)提供技術(shù)支持。

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Colony image segmentation and counting based on hyperspectral technology

Li Yanxiao1, Hu Xuetao1, Zhang Fang2, Shi Jiyong2※, Qiu Baijing1

(1.,212013,; 2.,,212013,)

Colony plate counting methods as the national standard method are common and traditional for quantity inspection of living bacteria in food and agricultural products. The colonies are counted by manual counting and computer vision counting methods because of the color difference between colonies and background (such as medium and the edge of petri dish). However, colonies and background with similar color will interfere with the colony segmentation and lead to the deviation in counting results. Considering colonies and background have different spectral information resulting from different chemical compositions, hyperspectral imaging technology can be applied to colony segmentation and adherent colonies separation combined with chemostics. The segmentation method of colony and background, separated method of adherent colonies and calculation method of colony number were developed for colony counting. The hyperspectral images of() colony plate were acquired in the wavelengths from 431 to 963 nm. Spectral information of colonies and background (medium and the edge of petri dish) was extracted after preprocessing hyperspectral images. Genetic algorithms (GA) was used for processing spectral data and eleven characteristic wavelengths were selected (604, 636, 790, 799, 748, 683, 492, 437, 558, 470 and 928 nm). Genetic Algorithms least Square Support Vector Machine (GA-LS-SVM) model was established for distinguishing colonies and background by using the spectral information at the eleven characteristic wavelengths. The identification model with identification rate of 97.22% indicated that the colony and background could be successfully distinguished. The segmentation method of colony and background was developed. The spectral information of every pixel was extracted to identify whether it is colony or background by using the identification model. The binary image of colony segmentation was obtained through the spatial information in hyperspectral images. The location of colony was assigned as 1 and the location of background was assigned as 0, resulting in colony segmentation. The hyperspectral image at 604 nm was used for segmentation of adherent colonies to obtain binary image of adherent colonies segmentation. The segmentation threshold between background and colony was set as 0.5. The results demonstrated that the colonies were successfully segmented from background and adherent colonies could be accurately separated. Finally, the isolated colonies were counted by contour tracking algorithm after colony segmentation from background and adherent colonies separation. For application, acquisition of hyperspectral image, colony segmentation, adhesion colonies separation and colony number calculation were used forcolony counting of real samples. The time required by the developed method was about 10 min. Its average relative error of colony count was 4.2% with the manual counting method as the standard method. In addition, the colony plate counting was performed by using computer vision counting method. The average relative error of colony counting was 8.3% which was higher than the developed method. These results indicated that this method performed better than computer vision counting method though the consuming time was longer than that spent by the automatic colony counter. This method with high accuracy can become a novel plate colony counting method and provide technical support for the detection of microbial quantity in food and agricultural products.

image segmentation; genetic algorithms; least square support vector machine; hyperspectral imaging technology; colony counting; chemometrics;

李艷肖，胡雪桃，張芳，等. 基于高光譜技術(shù)的菌落圖像分割與計(jì)數(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(20)：326-332.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.20.038 http://www.tcsae.org

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2020-08-04

2020-10-10

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0200708）；國(guó)家自然科學(xué)基金（61301239）；江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點(diǎn)項(xiàng)目（BE2019359）

李艷肖，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品快速檢測(cè)研究。Email：5983459@qq.com

石吉勇，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品、農(nóng)產(chǎn)品快速無(wú)損檢測(cè)研究。Email：shi_jiyong@ujs.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.20.038

O657.3

A

1002-6819(2020)-20-0326-07