張其琛， 江立波， 李熙雷

復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032

隨著老齡化問題逐漸加重，骨科退行性疾病的發(fā)生率逐漸升高，危害日益增加。其中骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)和椎間盤退變成為全球疾病負擔中導(dǎo)致失能生存年(years lived with disability, YLD)的最主要疾病[1]。

為減少手術(shù)等傳統(tǒng)治療方法對患者造成的身心負擔，研究者從分子醫(yī)學和生物工程等方面開展了大量工作。其中干細胞療法被人們寄予厚望，應(yīng)用胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)、誘導(dǎo)多潛能干細胞(induced pluripotent stem cell, IPSC)等進行軟骨和椎間盤修復(fù)再生的體外和動物實驗均取得了良好的結(jié)果[2-4]。

但是，應(yīng)用干細胞療法具有細胞泄露、潛在的癌變可能和造成椎間隙和關(guān)節(jié)腔感染的風險[5]。研究[6-7]表明，包括MSC在內(nèi)的多種細胞來源的外泌體可促進軟骨修復(fù)等過程。此外，外泌體還可通過多種生物學方式參與疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，外泌體逐漸成為退行性疾病方向的一大熱點。本文主要對不同細胞來源的外泌體在骨科退行性疾病中的研究進展進行綜述。

1 外泌體的來源和作用

外泌體是一種具有脂膜結(jié)構(gòu)的直徑為30～150 nm的小囊泡，可被多種細胞分泌，并已在血清、乳汁、精液等多種體液中被發(fā)現(xiàn)。外泌體與微囊泡、凋亡小體同屬細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)。EVs被認為是細胞間交流的重要方式，運輸miRNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，而對接收的細胞產(chǎn)生生物學效應(yīng)[8]。其中，外泌體可通過核內(nèi)體來源的多泡體(multivesicular bodies, MVBs)與胞膜融合并發(fā)生胞吐作用釋放到細胞外，而微囊泡則直接通過細胞膜出芽形成[9]。

憑借攜帶的內(nèi)容物和分泌迅速的特性，外泌體不僅可影響受體細胞的表型、細胞遷移、增殖，還可通過分泌出多余或有害的蛋白、脂質(zhì)、核酸維持親代細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[10]。外泌體攜帶的蛋白質(zhì)包括源細胞非特異性和源細胞特異性2類蛋白分子，其中前者包括和MVBs生成有關(guān)的Alix、腫瘤易感基因101(TSG101)、熱休克蛋白(Hsp60、Hsp70、Hsp90)和四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)等，而后者則根據(jù)源細胞類型有所不同。其中CD9、CD63、CD81等表面膜蛋白已作為外泌體識別和分選的重要標志物[11]。

2 MSC來源外泌體在骨科退行性疾病中的作用

盡管MSC來源豐富，但對臍帶、脂肪組織、骨髓等不同組織來源的MSC的研究[12]發(fā)現(xiàn)，其對軟骨細胞的營養(yǎng)作用是相似的。與此觀察結(jié)果相對應(yīng)，盡管來源不同的MSC外泌體的內(nèi)容物成分各異，卻并不影響其在軟骨再生和修復(fù)中的作用。

由于MSC外泌體的內(nèi)容物成分繁多，其具體參與軟骨再生及修復(fù)的機制仍未完全清楚。但根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，MSC來源外泌體參與軟骨修復(fù)、再生的機制主要涉及以下4個方面。

2.1 生物能量學 MSC來源外泌體的內(nèi)容物中包含豐富的糖酵解ATP，可生成相關(guān)酶類，如磷酸葡糖激酶、丙酮酸激酶等。這類酶可使細胞中ATP產(chǎn)量升高、糖酵解介導(dǎo)的合成代謝反應(yīng)增強，從而改善OA軟骨細胞因線粒體功能障礙、ATP不足而導(dǎo)致的軟骨細胞炎癥、過度凋亡和基質(zhì)分解代謝增強[13-14]。此外，盡管線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP比糖酵解更加高效，OA中軟骨細胞糖酵解的水平卻提高了10%～100%，足以彌補這種不足。且糖酵解為其他合成步驟提供了代謝中間產(chǎn)物并恢復(fù)了受損細胞的氧化還原電位，有助于軟骨細胞的損傷修復(fù)[15]。

2.2 細胞的增殖與分化 在OA的發(fā)展過程中，由于炎癥反應(yīng)的加劇，關(guān)節(jié)軟骨常伴隨細胞數(shù)量減少，且失去正常的結(jié)構(gòu)與功能。在軟骨的修復(fù)過程中，間質(zhì)細胞的增殖和向軟骨細胞的分化起到了重要作用[16]。而研究[17]顯示，MSC分泌的外泌體可促進軟骨細胞增殖而對關(guān)節(jié)軟骨具有相似的修復(fù)作用。而一系列細胞增殖與軟骨細胞分化信號通路關(guān)鍵分子，如SMAD、AKT和ERK通路等，均受到MSC外泌體中miRNA的密切調(diào)控。因此，MSC外泌體所含的150多種miRNA的作用受到越來越多的關(guān)注[18]。例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有誘導(dǎo)骨膜細胞、MSC向軟骨分化的作用。miR92a可與BMP的拮抗基因noggin3作用，正調(diào)控軟骨生發(fā)層的增殖，從而促進人咽軟骨的形成[19]。來自miR92a過表達的人MSC的外泌體也被證實可調(diào)控WNT5A的活性，增強軟骨發(fā)生、抑制軟骨基質(zhì)降解[20]。在軟骨形成的早期，WNT5A可激活增殖，抑制軟骨細胞的分化[21-22]。此外，WNT5A可激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，減少軟骨形成后期和成熟軟骨細胞中軟骨細胞外基質(zhì)的形成和合成[23]。而另一項研究[24]顯示，miR23b可下調(diào)人MSC中具有促成骨分化作用的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信號通路的活性，促進人MSC向軟骨細胞分化。

特異蛋白-1(specificity protein 1，Sp1)是轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，具有調(diào)節(jié)細胞凋亡和增殖的作用[25-26]。研究者[26]發(fā)現(xiàn)，Sp1可通過調(diào)控小鼠的膠原α1基因，抑制軟骨細胞的增殖。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)可刺激MSC外泌體中miR-135b的高表達，并下調(diào)Sp1的表達，促進人軟骨細胞增殖[27]。

然而，MSC外泌體富含的miRNA中，也有些在軟骨修復(fù)過程中扮演了負面角色。就如實驗[28]觀察到，miR145在TGF-β3介導(dǎo)的人MSC向軟骨細胞分化中表達下降。隨后被證實其通過抑制軟骨發(fā)生關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX9蛋白水平的表達而在早期軟骨分化中起到負面作用。還有一些miRNA則通過調(diào)控降解軟骨分化過程中起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)子的蛋白酶的活性間接影響這一過程。Slug蛋白就是軟骨分化中的一種重要負性調(diào)節(jié)子，其降解受到鼠雙微體基因MDM2的調(diào)控。而miR221下調(diào)MDM2，抑制了Slug的降解，從而阻礙人軟骨生發(fā)層細胞的增殖[29]。

此外，有體外研究[30]證明，人MSC外泌體也可促進人椎間盤中髓核細胞的增殖，但其具體機制仍不清楚。

2.3 細胞基質(zhì)的合成與降解 關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)和功能是由軟骨細胞與其間質(zhì)共同支持的。細胞外基質(zhì)主要含Ⅱ型膠原和蛋白聚糖以維持拉力強度和硬度。而在軟骨細胞外，還有一層狹窄的基質(zhì)條帶被特稱為“細胞周基質(zhì)”，其富含基底膜聚糖、聚糖蛋白、透明質(zhì)酸、膠原(以Ⅵ型和Ⅸ型膠原為主)、纖連蛋白。軟骨細胞胞膜上的感受器可感受生物化學和生物力學的變化且作為細胞周基質(zhì)中分子的受體，與之發(fā)生聯(lián)系，以保護軟骨細胞適應(yīng)變化。在OA過程中，軟骨細胞與細胞周基質(zhì)間正常的聯(lián)系被破壞，通過異常的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，金屬蛋白酶MMPs、聚蛋白多糖酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)被激活，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解[31]。

MSC外泌體中的miRNA可能在抑制軟骨ECM降解中發(fā)揮著重要作用。miR125b可抑制白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的人軟骨細胞中ADAMTS4的上調(diào)[32]。miR320則可下調(diào)IL-1β干預(yù)的人軟骨細胞中MMP13的表達，從而抑制ECM的降解[33]。

此外，體外研究[30]發(fā)現(xiàn)，人MSC來源外泌體可被退變的人髓核細胞攝取，抑制其MMP1、3的表達，并改善基質(zhì)合成情況。

2.4 免疫調(diào)節(jié) 損傷常伴隨著炎癥微環(huán)境的紊亂，IL-1β、IL-6、IL-8和MMP3等炎性細胞因子上調(diào)，加劇了隨后的軟骨基質(zhì)降解[34]。而MSC則可通過干擾素IFN-γ、TGF-β1、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、血紅素加氧酶-1(hemeoxygenasel，HO-1)、IL-6和前列素E2(prostaglandin E2，PGE2)等物質(zhì)的協(xié)同作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而減輕炎癥造成的軟骨損傷[35]。

MSC外泌體富含超過200種具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白，就使其成為了發(fā)揮這種協(xié)同作用的良好載體[36]。與此相一致的研究[37]結(jié)果表明，MSC外泌體可誘導(dǎo)IL-10和TGF-1β等抗炎因子高表達，并降低人單核巨噬細胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表達水平。

此外，研究[38]已證實，補體系統(tǒng)的過度激活在OA發(fā)病機制中具有重要作用。而MSC外泌體所富含的CD59則可通過和組成補體攻擊復(fù)合物的C8、C9結(jié)合，阻止MAC介導(dǎo)的細胞溶解，從而阻止OA的發(fā)展。

除去上述4個方面，MSC外泌體還可能通過調(diào)控細胞程序性死亡而具有對OA和椎間盤退變的潛在治療應(yīng)用價值。近期研究[39]發(fā)現(xiàn)，MSC外泌體可通過攜帶的miR-21限制PTEN活性，繼而激活PI3K/AKT信號通路，從而抑制髓核細胞的凋亡。

3 軟骨細胞外泌體在骨科退行性疾病中的作用

人們對軟骨來源外泌體的認識是從關(guān)節(jié)軟骨囊泡(articular cartilage vesicle，ACV)的發(fā)現(xiàn)開始的[40]。這類最早發(fā)現(xiàn)于OA患者關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的囊泡直徑在50～250 nm，包括微囊泡和外泌體。此外，當時的研究[41]發(fā)現(xiàn)，正常軟骨來源的ACV與OA軟骨ACV內(nèi)容物的蛋白含量、致礦化能力均有顯著差異。后續(xù)研究[42-44]證實，OA軟骨細胞ACV可形成病理性的鈣鹽結(jié)晶，且其與正常軟骨細胞ACV內(nèi)容物的蛋白質(zhì)、RNA成分均不同。OA軟骨ACV中蛋白聚糖含量下降，而玻連蛋白、發(fā)育內(nèi)皮基因1(developmental endothelial locus-1，DEL-1)、絲氨酸蛋白酶HtrA1的表達上升，與OA患者關(guān)節(jié)軟骨的變化相符。此外，通過ACV進行的細胞物質(zhì)交流，OA軟骨細胞ACV可影響正常細胞的表型，從而加重OA。但目前對ACV中微囊泡和外泌體在上述過程中各自的作用仍未完全闡釋清楚。

同樣地，人們也在嘗試探究正常軟骨細胞來源的外泌體對軟骨再生和修復(fù)的作用。研究人員提取了成熟兔軟骨細胞來源的外泌體，并注射到預(yù)先植入軟骨祖細胞-海藻酸鈉移植物的小鼠皮下。體內(nèi)外研究[45]均證實，軟骨來源的外泌體促進了軟骨祖細胞的穩(wěn)定異位軟骨形成。這個發(fā)現(xiàn)提供了一種合適的軟骨生成誘導(dǎo)物，以修復(fù)軟骨的缺損。

近期研究[46]還發(fā)現(xiàn)，正常人軟骨細胞與OA軟骨細胞分泌的外泌體中miRNA的表達譜有明顯差異。通過差異分析，研究者發(fā)現(xiàn)OA軟骨細胞分泌的外泌體中miR-95-5p水平顯著下調(diào)。而過表達miR-95-5p的人原代軟骨細胞外泌體則可通過抑制組蛋白去乙酰化酶(HDAC)2/8的活性，從而解除其對軟骨特異性基因Ⅱ型膠原α1(COL2A1)、蛋白聚糖aggrecan等表達的抑制，并抑制IL-1β、MMPs的表達，從而減少軟骨破壞。

有趣的是，軟骨細胞外泌體內(nèi)miRNA的表達譜與其親本細胞也有明顯差異。在該研究[47]親本細胞和其外泌體所涉及的全部372種miRNA中，有62種在親本細胞和其外泌體中表達存在差異。在軟骨細胞外泌體差異富集的前20種miRNA中，不乏已報道與OA等軟骨疾病的發(fā)生、發(fā)展及軟骨再生、修復(fù)相關(guān)者，提示軟骨細胞分泌的外泌體在軟骨分化和維持軟骨細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用，見表1。

表1 軟骨細胞來源外泌體中miRNA在軟骨疾病發(fā)生、修復(fù)及再生

4 其他細胞來源外泌體在骨科退行性疾病中的作用

在風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)患者的關(guān)節(jié)囊滑液中，存在著高含量的細胞因子、趨化因子，而滑膜的炎癥和新生血管形成與RA和OA的發(fā)展均密不可分。在RA患者中，滑膜成纖維細胞(synovial fibroblast, SFB)可通過來自于粒細胞、單核細胞等活化的免疫細胞釋放的外泌體調(diào)節(jié)其炎性物質(zhì)的釋放[52]。類似地，在OA患者中，炎癥刺激下的SFB也扮演了加重OA發(fā)展的負面角色。據(jù)報道[53]，IL-1β刺激的SFB可通過其釋放的外泌體在體內(nèi)外實驗中誘導(dǎo)出類似OA的病理表現(xiàn)。

目前髓核細胞外泌體的作用研究甚少。但有報道[30]發(fā)現(xiàn)，正常的人髓核細胞外泌體具有促進BMSC遷移和向髓核樣細胞分化的作用，提示利用健康髓核細胞外泌體治療椎間盤退變的潛在價值。

5 外泌體對骨科退行性疾病的應(yīng)用展望

由于應(yīng)用MSC對OA患者治療的結(jié)果基本證明了這一方式的安全性，因此推測MSC來源外泌體應(yīng)具有類似的生物安全性。但是應(yīng)用MSC來源外泌體的療效、體內(nèi)動力學和生物分布特點還有待大型動物和臨床試驗的研究。此外，應(yīng)用MSC來源外泌體促進軟骨分化、增殖具有新生軟骨細胞肥大、血管新生等問題。與之相比，軟骨細胞來源外泌體沒有類似缺點，并具有同樣高效的促軟骨分化增殖特點[45]。但軟骨細胞外泌體與MSC來源外泌體相比，又具有親本細胞來源局限、不易大量獲得的缺點。這大大制約了其臨床應(yīng)用的前景。此外，對于軟骨細胞外泌體參與軟骨疾病發(fā)生、修復(fù)及再生的機制研究遠遠少于MSC來源外泌體。

綜上所述，天然細胞來源外泌體內(nèi)容物在軟骨細胞再生、修復(fù)方面具有促進和抑制的兩面性[54]。如何通過人工修飾或合成具有類似天然細胞來源外泌體結(jié)構(gòu)、功能的納米囊泡，將成為未來外泌體療法走向臨床的關(guān)鍵。