吳曉珊 倪峰 高毓瀅 黃仁杰

摘 要 目的：設(shè)計(jì)合成γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯（γ-PGA-AMP），并進(jìn)行表征和體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。方法：利用酯化反應(yīng)將蛇葡萄素接載在γ-聚谷氨酸上生成合成產(chǎn)物。采用紫外光譜法、傅里葉紅外光譜法、氫-1核磁共振法及元素分析等方法對(duì)合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;采用紫外吸收光譜法在293 nm波長(zhǎng)處測(cè)定合成產(chǎn)物中蛇葡萄素的含量。以5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT法檢測(cè)γ-PGA-AMP、蛇葡萄素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果：表征結(jié)果顯示，蛇葡萄素的7位游離羥基與γ-聚谷氨酸a位碳上的羧基已發(fā)生了酯化反應(yīng)，合成產(chǎn)物即為γ-PGA-AMP（產(chǎn)率為55.7%），其中蛇葡萄素含量為32.3%。γ-PGA-AMP和蛇葡萄素對(duì)MCF-7、HepG2和A549細(xì)胞均有明顯的抑制作用;γ-PGA-AMP對(duì)上述3種腫瘤細(xì)胞的IC50分別為40.19、28.29、55.23 μg/mL，蛇葡萄素的IC50分別為105.30、81.23、130.10 μg/mL，5-FU的IC50分別為24.72、87.98、30.99 μg/mL。結(jié)論：成功合成具有體外抗腫瘤活性的γ-PGA-AMP，且抗腫瘤活性強(qiáng)于蛇葡萄素。

關(guān)鍵詞 蛇葡萄素;γ-聚谷氨酸;高分子化合物;合成;表征;抗腫瘤作用

中圖分類號(hào) R284.3;R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）22-2720-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To design and synthesize poly （γ-glutamic acid）-ampelopsin （γ-PGA-AMP）， and to characterize it and evaluate its anti-tumor activity in vitro. METHODS： Synthetic product was produced through an esterification reaction between γ-PGA and ampelopsin. The structure of synthetic product was characterized by the UV spectrophotometry， Fourier transform infrared （FT-IR） spectroscopy，1H-NMR spectra and the quantitative elemental analysis. The content of ampelopsin in synthetic product was determined by UV absorption spectrometry at 292 nm. Using 5-FU as positive control， MTT assay was used to determine inhibitory effects of γ-PGA-AMP and ampelopsin on human breast cancer cell MCF-7， human liver cancer cell HepG2 and human lung cancer cell A549. The IC50 was calculated. RESULTS： The results showed that the free 7-hydroxyl group of ampelopsin and the a-carboxyl group of γ-polyglutamic acid had been esterified to obtain γ-PGA-AMP; the yield of γ-PGA-AMP was 55.7%， and the content of ampelopsin was 32.3%. The inhibitory effect of γ-PGA-AMP and ampelopsin on MCF-7， HepG2 and A549 cells was obvious. IC50 of γ-PGA-AMP （to 3 above tumor cells） were 40.19， 28.29 and 55.23 μg/mL， those of ampelopsin were 105.30， 81.23， 130.10 μg/mL， those of 5-FU were 24.72， 87.98， 30.99 μg/mL， respectively. CONCLUSIONS： γ-PGA-AMP with anti-tumor effect in vitro is synthesized successfully， and its anti-tumor effect is stronger than that of ampelopsin.

KEYWORDS? ?Ampelopsin; Poly （γ-glutamic acid）; Polymer compounds; Synthesis; Characterization; Anti-tumor effect

蛇葡萄素的化學(xué)名為3，5，7，3′，4′，5′-六羥基-2，3-二氫黃酮，分子式為C15H12O8，又名二氫楊梅素、雙氫楊梅樹(shù)皮素、福建茶素等，是一種多酚羥基雙氫黃酮醇，屬黃酮類化合物[1-2]，主要存在于大葉蛇葡萄[3]、藤茶[4]等多種植物中。蛇葡萄素的毒性低，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、止咳、抑菌、保肝護(hù)肝、改善肝纖維化、降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等多種藥理活性[5-7]。目前，蛇葡萄素的研究熱點(diǎn)在其抗腫瘤活性上，但是在研究過(guò)程中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)該化合物的體內(nèi)抗癌效果并不理想，分析原因可能與該化合物溶解性和穩(wěn)定性較差，同時(shí)存在較多的作用靶點(diǎn)，選擇性不強(qiáng)、藥理效應(yīng)較弱等不足有關(guān)[8-9]。針對(duì)上述不足，本課題組擬選用高分子聚合物γ-聚谷氨酸對(duì)蛇葡萄素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。γ-聚谷氨酸是一種天然高分子聚合物，是由谷氨酸重復(fù)單元通過(guò)α-氨基與γ-羧基之間的酰胺鍵連接而成，是一種可生物降解、無(wú)毒、無(wú)免疫源性的藥物載體[10-11]。γ-聚谷氨酸的分子鏈上具有活性較高的側(cè)鏈羧基，易與一些抗癌藥物形成高分子藥物復(fù)合體，具有良好的藥動(dòng)學(xué)特性，能通過(guò)高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng)（Enhanced permeability and retention effect，EPR）使藥物在腫瘤組織中積累[12]?？梢?jiàn)，γ-聚谷氨酸是一類較理想的體內(nèi)藥用高分子材料?；诖耍菊n題組將蛇葡萄素連接在γ-聚谷氨酸的羧基端以合成γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯（γ-PGA-AMP），并對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行表征和抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，旨在提高蛇葡萄素的抗腫瘤活性，并為符合臨床需求抗腫瘤新藥的研發(fā)提供參考，為腫瘤治療提供新的選擇。蛇葡萄素、γ-聚谷氨酸和γ-PGA-AMP的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

1 材料

1.1 儀器

FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;DF-101S型集熱式磁力攪拌器（常州國(guó)華儀器有限公司）;1835型烏氏黏度計(jì)（毛細(xì)管內(nèi)徑：0.5 mm，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）;UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）;740SX型傅里葉紅外光譜（FT-IR）儀（美國(guó)Nicolet公司）;Unity 500MHz型核磁共振（NMR）儀（美國(guó)Varian公司）;Vario ELⅢ型元素分析儀（德國(guó)Elementar公司）;HF212UV型CO2培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)）;ELX800型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.2 藥品與試劑

蛇葡萄素原料藥（張家界生力生物有限公司，批號(hào)：160726，純度：>98.5%）;γ-聚谷氨酸原料藥（分子量：約2×106 Da，南京軒凱生物科技有限公司，批號(hào)：20181004，純度：>92%）;透析袋（透過(guò)分子量：8 000～14 000 Da，美國(guó)聯(lián)合碳化物公司）;RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)：2016-12）、胎牛血清（批號(hào)：2017-09）、青-鏈霉素雙抗（批號(hào)：2017-05）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MTT試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20160922）;5?氟尿嘧啶原料藥（5-FU，美國(guó)Selleck公司，批號(hào)：s1209，純度：99.97%）;二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，批號(hào)：20170314，化學(xué)純）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，批號(hào)：20160701，分析純）、鹽酸（批號(hào)：20161018，分析純）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：20160610，分析純）、乙醚（批號(hào)：20160518，分析純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;G 25×75型硅膠G薄層層析制備板（粒徑：100～200目，青島海洋化工有限公司）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549等細(xì)胞株均由福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，其原代細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 小分子γ-聚谷氨酸的制備

參考文獻(xiàn)方法[13]，首先，純化大分子γ-聚谷氨酸原料藥：取γ-聚谷氨酸原料藥100 g，用水500 mL溶解，加入無(wú)水乙醇1 500 mL，靜置得到γ-聚谷氨酸沉淀;取沉淀，用去離子水500 mL重新溶解、超濾，除去不溶物，再次加入無(wú)水乙醇1 500 mL沉淀后，對(duì)所得沉淀進(jìn)行冷凍干燥，即得白色塊狀大分子γ-聚谷氨酸。其次，采用高溫降解法降解大分子γ-聚谷氨酸：取上述大分子γ-聚谷氨酸10 g，用水配制成2%（下同）的水溶液，用鹽酸調(diào)pH至2～3，高溫高壓（121 ℃、0.1 MPa）處理20 min后，立即冰浴冷卻;用NaOH調(diào)pH至7～8，冷凍干燥，即得白色棉絮狀小分子γ-聚谷氨酸鈉鹽。最后，制備小分子γ-聚谷氨酸：用水配制2%的小分子γ-聚谷氨酸鈉鹽水溶液，用鹽酸調(diào)pH至2.0左右，用水透析48 h，冷凍干燥后，即得白色絮狀小分子γ-聚谷氨酸。

2.2 γ-PGA-AMP的合成

取蛇葡萄素0.59 g（約1.8 mmol）溶于DMSO 20 mL中，于室溫下攪拌溶解，加入DCC 0.37 g（約1.8 mmol）、DMAP 0.1 g（約0.82 mmol），再加入含有小分子γ-聚谷氨酸1.24 g（約9.37 mmol）的DMSO 180 mL，置于集熱式磁力攪拌器中，于40 ℃下攪拌反應(yīng)。利用蛇葡萄素與三氯化鐵溶液反應(yīng)顯紫色，采用薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)酯化反應(yīng)過(guò)程。反應(yīng)進(jìn)行24 h時(shí)，TLC顯示原料蛇葡萄素點(diǎn)消失，停止反應(yīng)。然后在反應(yīng)液中加入10倍體積的無(wú)水乙醚，洗滌、振蕩，4 ℃下靜置過(guò)夜待溶液分為兩層。收集下層淺黃色溶液，冷凍干燥后，即得黃色粉狀合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP 1.02 g，產(chǎn)率為55.7%。

2.3 表征

2.3.1 紫外光譜檢測(cè) 取合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP、蛇葡萄素原料藥各0.005 g，分別用DMSO 1 mL溶解，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖2（γ-聚谷氨酸在此范圍內(nèi)無(wú)最大吸收，圖略）。

由圖2可見(jiàn)，γ-PGA-AMP苯環(huán)上的最大吸收峰位于293.66 nm波長(zhǎng)處;與蛇葡萄素相比，苯環(huán)上最大吸收峰紅移約2 nm。這可能是由于蛇葡萄素的7位羥基與聚谷氨酸a位碳上的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，聚谷氨酸酯基團(tuán)的吸電子能力略強(qiáng)于羥基基團(tuán)，降低了分子內(nèi)電子躍遷的能級(jí)差，使分子紫外吸收發(fā)生了紅移[14-15]。另外，γ-PGA-AMP紫外光譜中200～270 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有多個(gè)γ-聚谷氨酸羧基雙鍵的吸收峰。這可能與γ-聚谷氨酸結(jié)構(gòu)中處于分子鏈末端和分子鏈內(nèi)部的羰基基團(tuán)的吸收波長(zhǎng)略有差異有關(guān)。

2.3.2 FT-IR檢測(cè) 取合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP、蛇葡萄素原料藥各適量，分別與少量KBr混勻后壓片，于20～25 ℃下，使用FT-IR光譜儀檢測(cè)400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的FT-IR光譜，結(jié)果見(jiàn)圖3（γ-聚谷氨酸在此范圍內(nèi)無(wú)最大吸收，圖略）。

由合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP的FT-IR光譜圖（圖3A）可見(jiàn)，酯鍵上的碳氧單鍵σC-O：1 090、1 249 cm-1;酯鍵的羰基σC=O：1 728 cm-1;羧酸的羰基σC=O：1 646 cm-1;亞甲基σC-H：2 921 cm-1;芳環(huán)σAr-H：955 cm-1，δAr-H：1 352、1 315 cm-1（σ：伸縮震動(dòng);δ：面內(nèi)彎曲震動(dòng)）。對(duì)比蛇葡萄素的FT-IR光譜圖（圖3B），3 630 cm-1處蛇葡萄素游離羥基的吸收峰已經(jīng)消失，1 650 cm-1處的羰基吸收峰由于取代基團(tuán)的改變位移至1 646 cm-1。這提示蛇葡萄素上的游離羥基與γ-聚谷氨酸上的羧基可能已發(fā)生了酯化反應(yīng)。

綜上所述，本研究成功合成了具有體外抗腫瘤活性的γ-PGA-AMP，且抗腫瘤活性強(qiáng)于蛇葡萄素，為抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供了新思路。

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（收稿日期：2020-06-16 修回日期：2020-10-15）

（編輯：鄒麗娟）