田 雯， 薛 站， 霍曉敏， 周康盛， 衛(wèi)亞麗， 肖 麗， 吳良艷， 譚承建*

(1.貴州民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州 貴陽550025； 2.貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，貴州 貴陽550025)

赪桐〔Clerodendrumjaponicum(Thunb.) Sweet〕為馬鞭草科大青屬植物，主要分布在湖南、廣東、云南、貴州及四川等省，生長于平原、山谷和溪邊等地域。赪桐花具有寧心、鎮(zhèn)靜、安神和止外傷出血功效，主要用于心率失常、失眠及痔瘡出血的治療；葉可祛風(fēng)化瘀、解毒消腫，主要用于慢性神經(jīng)血管性疾病、瘀傷及癰腫的治療；根和莖可以清熱利尿、涼血止血，常在肺熱咳嗽、熱淋、血熱出血、咯血、痔瘡出血和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等方面應(yīng)用。研究表明，赪桐根石油醚及水提取物有較強的抗炎效果[1-2]。

目前，從赪桐中已分離鑒定出30多個化合物[3-5]，主要為萜類、苯乙醇苷類及環(huán)肽類等類型[3，6]?；瘜W(xué)成分的研究主要集中于中等極性和水溶性部位，而對其石油醚部位的研究較少。此外，赪桐會散發(fā)出刺鼻的氣味，從化學(xué)生態(tài)學(xué)角度看，可能是由于赪桐在漫長生長過程中形成的競爭適應(yīng)，其中的揮發(fā)性成分，可能是防止食植性昆蟲侵擾的化學(xué)防御物質(zhì)。

斜紋夜蛾(Spodopteralitura)以幼蟲危害，可啃食蔬菜、作物和果樹等99科290余種植物，其中喜食甘藍、白菜、蓮藕、蕹菜、芋艿、豆類、瓜類、茄、辣椒、番茄、甘薯、棉花、大豆、玉米和煙草等90種植物。斜紋夜蛾對農(nóng)業(yè)的危害具有較強的隱蔽性和突然暴發(fā)性的特點。一旦爆發(fā)，可使農(nóng)作物平均減產(chǎn)20%～40%，嚴重者減產(chǎn)60%，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失[7-9]。據(jù)FAO報告，病蟲害導(dǎo)致全球每年240～480億美元的損失，其中斜紋夜蛾為主要農(nóng)業(yè)害蟲之一。目前，生產(chǎn)中常用有機氯、有機磷、氨基甲酸脂類和擬除蟲菊酯類等化學(xué)殺蟲劑控制害蟲。但是，化學(xué)農(nóng)藥降解困難，存在潛在的環(huán)境風(fēng)險。因此，從植物中尋找對抗斜紋夜蛾危害的防治方法，是目前農(nóng)業(yè)病蟲害防治的重要途徑。從化學(xué)生態(tài)學(xué)的角度出發(fā)，以赪桐揮發(fā)性成分為研究對象，通過GC-MS聯(lián)用的方法對其揮發(fā)性成分進行研究，找尋其中的化學(xué)防御物質(zhì)基礎(chǔ)，并采用浸蟲、浸葉法研究其對斜紋夜蛾幼蟲的殺蟲活性，驗證其化學(xué)防御的可能性，為后續(xù)生物農(nóng)藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣品 采自貴州省獨山縣，經(jīng)昆明植分生物技術(shù)有限公司鑒定為馬鞭草科大青屬植物赪桐〔C.japonicum(Thunb.) Sweet〕。標(biāo)本存放于貴州民族大學(xué)天然藥物化學(xué)實驗室(標(biāo)本編號：KMZFC20190708-2)。

1.1.2 試劑 60～90℃石油醚(AR)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；吐溫-80(CP)，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 HWS-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；AKRY-UP-1816超純水機，成都艾柯水處理有限公司；YC-D205超聲波加濕器，北京亞都環(huán)?？萍加邢薰荆?00 mL燒杯，四川蜀玻有限責(zé)任公司；HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.1.4 其他 斜紋夜蛾蟲卵，購自濟源科云生物有限公司；白菜，購自貴州醫(yī)科大學(xué)綠谷超市。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 供試藥液制備。赪桐地上部分粉碎，準(zhǔn)確稱取赪桐粗粉50 g，加入石油醚350 mL，溫度60℃，熱回流提取3次，每次1 h。提取液濃縮得墨綠色、具有特殊氣味的提取物0.924 g。以上過程重復(fù)提取8次，共得浸膏7.392 g。精確稱量赪桐石油醚提取物800 mg、600 mg、400 mg、200 mg、100 mg、50 mg及25 mg，分別置于10 mL容量瓶，加入5%吐溫-80水溶液至容量瓶刻度，配制成濃度為80.0 mg/mL、60.0 mg/mL、40.0 mg/mL、20.0 mg/mL、10.0 mg/mL、5.0 mg/mL和2.5 mg/mL的供試藥液，震蕩搖勻后備用。以5%吐溫-80水溶液和純水作空白對照。

2) 斜紋夜蛾飼養(yǎng)。參照杜鵑[10]的方法飼養(yǎng)斜紋夜蛾幼蟲。在500 mL燒杯中放入洗凈晾干的白菜葉，將斜紋夜蛾蟲卵置于其上，于相對濕度40%，光照L∶D為16∶8，溫度27℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。待幼蟲孵出后保持溫度不變，每48 h定時更換菜葉，同時用軟毛刷將幼蟲轉(zhuǎn)移至新鮮菜葉上。幼蟲蛻皮1次為1日齡，幼蟲達3日齡時挑選810只健康、大小相同的斜紋夜蛾幼蟲，每30只1組，備用。

1.2.2 試驗設(shè)計

1) 石油醚提取物化學(xué)成分的GC-MS分析。采用GC-MS分析石油醚提取物的化學(xué)成分。GC條件：FLM FB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱，柱溫46℃，保留2 min，以8℃/min升溫至118℃，再以6℃/min升溫至310℃，保留11 min，運行54 min；汽化室溫度250℃；載氣為He；柱前壓7.41 Psi，流量1.0 mL/min；分流進樣；溶劑延遲4 min。MS條件：EI源，離子源溫度230℃，電子能量70 eV，接口溫度280℃，質(zhì)量范圍29～500 amu。

2) 赪桐石油醚提取物對斜紋夜蛾的殺蟲活性。根據(jù)處理濃度試驗設(shè)9個處理，依次為80.0 mg/mL、60.0 mg/mL、40.0 mg/mL、20.0 mg/mL、10.0 mg/mL、5.0 mg/mL和2.5 mg/mL，以及5%吐溫-80水溶液(CK1)和純水(CK2)。將菜葉去梗洗凈晾干，剪成5 cm×5 cm的小片備用。采用浸蟲浸葉法[11]，將葉片分別放入各處理溶液中浸泡20 s，取出晾干后分別置于燒杯中并編號，每個燒杯中放入菜葉6片；再將每組幼蟲分別在各處理溶液中浸泡5 s后取出，放入對應(yīng)的放有菜葉的燒杯中，每個杯中放10只。3次重復(fù)，共27組。處理后的幼蟲放入相對濕度40%，光照L∶D為16∶8，溫度27℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h觀察1次并記錄幼蟲死亡數(shù)據(jù)，觀察至72 h結(jié)束。用棉簽輕輕撥動其尾部，有反應(yīng)的判斷為活，無反應(yīng)或干癟的判斷為死亡。根據(jù)死亡數(shù)量計算其死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和SPSS 21.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)并計算半數(shù)致死濃度LC50值[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 赪桐石油醚提取物的化學(xué)成分

通過GC-MS分析獲得赪桐石油醚提取樣品的總離子流(圖1)經(jīng)計算機質(zhì)譜系統(tǒng)檢索并核對Nist2014和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜后確定，赪桐石油醚提取樣品中共含有21種揮發(fā)性成分；經(jīng)峰面積歸一化法測定21種揮發(fā)性化合物的相對質(zhì)量分數(shù)，占總提取物的71.347%。從表1看出，赪桐石油醚提取物的化合物類型有脂肪族、萜類和芳香族，脂肪族和萜類是其主要組成部分，脂肪族化合物17種，占石油醚提取物總種數(shù)的56.967%，其中，主要有油酸、亞麻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、新植二烯和六氫法尼基丙酮等，其相對含量分別為37.974%、6.868%、4.661%、3.727%、1.379%和1.008%；萜類化合物3種，占石油醚提取物總種數(shù)的11.763%，分別為葉綠醇、芳樟醇和二氫獼猴桃內(nèi)酯，其相對含量為10.506%、0.990%和0.267%；芳香族化合物1種，占石油醚提取物總種數(shù)的2.617%，為維生素E，其相對含量為2.617%。

表1 赪桐全草石油醚提取物成分及相對百分含量

表2 不同濃度赪桐石油醚提取物浸蟲浸葉處理斜紋夜蛾幼蟲的死亡率

2.2 赪桐石油醚提取物對斜紋夜蛾的殺蟲活性

由表2可知，不同濃度赪桐石油醚提取物浸蟲浸葉處理斜紋夜蛾幼蟲24 h、48 h及72 h死亡率。赪桐石油醚提取物濃度為80.0 mg/mL、60.0 mg/mL和40.0 mg/mL時，表現(xiàn)出較強的殺蟲活性，在處理72 h時死亡率最高達98.9%，最低為92.2%；大部分幼蟲在處理24 h內(nèi)死亡。當(dāng)濃度為20.0 mg/mL、10.0 mg/mL和5.0 mg/mL時，24 h時死亡率分別為72.2%、53.3%和32.2%；濃度為10.0 mg/mL時，72 h內(nèi)對斜紋夜蛾的殺滅效果為54.4%。濃度為2.5 mg/mL時，72 h內(nèi)的殺滅活性較弱，死亡率僅15.6%，不及5%吐溫-80水溶液(CK1)的殺滅效果。表明，赪桐石油醚提取物在抗斜紋夜蛾幼蟲生物活性方面具有較好的量效關(guān)系。經(jīng)擬合得赪桐石油醚提取物對斜紋夜蛾3日齡幼蟲的毒力回歸方程：Y=-2.739+2.494X(R2=4.230，P=0.517)，半數(shù)致死濃度為12.534 mg/mL，95%置信區(qū)間為10.405～14.719 mg/mL。

3 結(jié)論與討論

研究表明，采用GC-MS分析、鑒定出赪桐石油醚提取物的化學(xué)成分主要有油酸、亞麻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、新植二烯、六氫法尼基丙酮、葉綠醇及維生素E等21種揮發(fā)性化合物，分屬脂肪族、萜類和芳香族，占總提取物的71.347%；赪桐石油醚提取物對斜紋夜蛾幼蟲具有較強的殺蟲生物活性(LC50為12.534 mg/mL)。有研究報道，棕櫚酸甲酯可避免蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)和葡萄小卷蛾(Lobesiabotrana)過度密集的產(chǎn)卵和重復(fù)性產(chǎn)卵[13-14]。黃蜂通過噴出棕櫚酸甲酯防止螞蟻襲擊[15]。棕櫚酸甲酯對朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)具有觸殺作用，與表面活性劑Silwet L-77混合后能提高其殺螨效果[16]。芳樟醇為鏈狀萜烯醇類化合物，具有抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)靜、驅(qū)蟲和殺蟲等生物活性[17]，對菜青蟲(Pierisrapae)產(chǎn)生顯著的拒食作用[18]。芳樟醇能毒殺和熏殺荔枝蒂蛀蟲(Conopomorphasinensis)的蛹、蟲卵及成蟲，殺滅作用隨濃度提高而增強，對荔枝蒂蛀蟲蟲卵的孵化和蛹的羽化過程具有一定的抑制作用[19]。六氫法尼基丙酮有驅(qū)蚊蟲作用[20]。表明，上述化合物具有一定的殺蟲活性，可能一定程度上代表赪桐石油醚部位的殺蟲活性，但其對斜紋夜蛾幼蟲具體的抗生物活性，還需要進一步驗證。該研究為后續(xù)赪桐揮發(fā)性殺蟲成分的探討奠定了基礎(chǔ)。然而，該研究中揮發(fā)性化學(xué)成分被檢出較少，可能由于其揮發(fā)油中新化學(xué)成分較多亦或相關(guān)化合物未被已有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫收錄。同時，該提取物中是否還存在其他殺蟲生物活性成分，還有待進一步研究。