強(qiáng) 遙， 廣業(yè)蘭， 秦雙林， 張凱東， 楊渭澄， 蔣軍喜*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045； 2.上海市崇明區(qū)長興鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，上海 201913)

辣椒疫病是危害辣椒的主要病害之一[1]，近年來在江西省南昌市發(fā)生嚴(yán)重，對當(dāng)?shù)乩苯樊a(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。該病可危害辣椒莖桿、葉片和果實(shí)等部位，在病部產(chǎn)生暗綠色大面積軟腐癥狀，導(dǎo)致植株萎蔫直至死亡[2]。辣椒疫病的病原物為色菌界(Chromista)卵菌門(Oomycota)疫霉屬(Phytophthora)真菌，其主要種類為辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)[3-4]，但寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)也能引起辣椒疫病[5-6]。辣椒疫病作為南昌市一種重要的蔬菜病害，已從病原菌生物學(xué)、品種抗性及殺菌劑篩選等多方面進(jìn)行了研究[7-8]，但未見對其進(jìn)行系統(tǒng)病原鑒定的研究報(bào)道。鑒于此，從南昌市辣椒田間采集病樣，采用病原菌分離培養(yǎng)、回接致病性觀察及形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合鑒定南昌市辣椒疫病的病原菌種類，以期為該病的防治和進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株 2019年7月從南昌市郊采集呈典型癥狀的辣椒疫病病株。

1.1.2 試劑 Ezup 柱式真菌基因組DNA提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；ITS1/ITS4通用引物，2×Taq PCRMaster Mix，北京天根公司；5×TAE 緩沖液、無水乙醇、75%乙醇、0.1%升汞、瓊脂糖及2000 DNA marker，市購。

1.2 方法

1.2.1 病菌分離及純化 根據(jù)《植病研究法》[9]中描述的組織分離法，對病株樣品進(jìn)行病菌分離。從病斑的病健交界處剪取3 mm×3 mm大小的組織塊，先將其在75%乙醇溶液中浸泡15 s，再用0.1%的升汞溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次。隨即將處理好的組織塊移入胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)平板上并置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出后挑取菌落邊緣的菌絲體進(jìn)行病原菌純化，將獲得的菌株置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌致病性測定 純化后的菌落培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致，從中隨機(jī)選取2個菌株L1和L2測定其致病性。將分離獲得的菌株分別接種在CA平板上于26℃培養(yǎng)5 d，打取直徑5 mm的菌餅，同時制備濃度為1×106個/mL游動孢子懸浮液，分別采用菌餅接種法和游動孢子懸浮液針刺法對6葉期健康辣椒幼苗葉片和莖桿中部接種，并接種空白培養(yǎng)基和蒸餾水作對照。每個處理接種3株辣椒，3次重復(fù)。將接種幼苗在26℃培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，每天觀察和記載發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌的鑒定

1) 形態(tài)學(xué)。將待鑒定菌株接種在CA平板中央，26℃、12 h/12 h光暗培養(yǎng)，逐日觀察菌落生長情況。待病原菌產(chǎn)生孢子囊后制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌菌絲隔膜的有無、游動孢子囊以及游動孢子的形態(tài)特征，將獲得的觀察結(jié)果與文獻(xiàn)[10-12]對照，從形態(tài)上鑒定病原菌。

2) 分子生物學(xué)。隨機(jī)選取2個菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將各菌株接入PDB培養(yǎng)基中26℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，過濾菌絲體，用液氮研磨成粉末，采用Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒按其說明提取病原菌基因組DNA。利用真核生物通用引物ITS1/ITS4(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對提取的病原菌基因組DNA進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增。反應(yīng)總體積25 μL：ITS1 /ITS4各1 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃補(bǔ)平10 min。獲得的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，將測得的原始序列用DNAStar (Madison Wisconsin, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Blast工具在GenBank中進(jìn)行序列同源性搜索，取相似性最高的序列和測定序列在Clustal V程序中進(jìn)行完全比對，然后利用Mega 5.0以鄰位相連(Neighbor-joining，NJ)算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及形態(tài)特征鑒定

從病樣中共分離獲得16種真菌菌株，其培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致。從圖1看出，在CA平板上菌落呈白色，邊緣整齊，菌絲稠密呈絨毛狀，氣生菌絲中等茂盛；菌落生長速率為13.5 mm/d，7 d后長滿整個平板。鏡檢發(fā)現(xiàn)，初期菌絲一般無隔，老熟菌絲或菌絲產(chǎn)生游動孢子囊時有隔。孢子囊卵圓形或近球形，有乳突，孢子囊大小(25.00～50.00) μm×(21.25～40.00) μm，長寬比1.00～1.50。孢子囊在水中釋放游動孢子，游動孢子腎形，雙鞭毛。綜合菌落形態(tài)、孢子囊及游動孢子形態(tài)大小，結(jié)合文獻(xiàn)[10-12]的形態(tài)特征描述，將辣椒疫病病原菌初步鑒定為辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)。

2.2 分離病原菌的回接試驗(yàn)

從圖2看出，辣椒疫病在田間危害莖桿、葉片和果實(shí)等各部位，莖桿發(fā)病主要發(fā)生于莖基部及枝桿分叉處，病部暗綠色，皮層軟腐，易導(dǎo)致植株部分或全株萎蔫死亡；葉片和果實(shí)可在任意部位發(fā)病，病部表現(xiàn)大面積暗綠色軟腐，很快導(dǎo)致整葉和整果腐爛；田間潮濕時，在各病部表面易見一層白色稀疏的霉層。從圖3看出，菌餅接種，3 d后辣椒葉片出現(xiàn)大面積暗綠色水漬狀腐爛癥狀；游動孢子懸浮液接種莖桿，3 d后辣椒幼苗出現(xiàn)莖桿縊縮，5 d后出現(xiàn)整株萎蔫現(xiàn)象，1周后辣椒幼苗干枯致死，癥狀與辣椒疫病自然發(fā)病癥狀相符。對接種發(fā)病的病葉和病苗進(jìn)行病原菌再分離，通過菌落和病原菌形態(tài)觀察以及ITS序列分析，表明再分離的病原物與原接種病菌一致。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

從圖4看出，菌株L1和L2的基因組DNA經(jīng)rDNA-ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增后，均獲得長約840 bp的DNA片段；序列測定表明，2個菌株的rDNA-ITS的序列長度均為801 bp(不包括兩端引物序列)且序列完全相同，其在GenBank中的序列登錄號分別為MT740810和MT880222。將該片段序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對的結(jié)果顯示，菌株L1和L2與PhytophthoracapsicaOCPC13(登錄號：KC677815)的序列同源性最高，達(dá)99.88%。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取疫霉屬不同種的ITS序列，以Peronosporacacuminis作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，菌株L1和L2與辣椒疫霉菌的rDNA-ITS 聚在一起，而外群菌株P(guān)eronosporacacuminis則以較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系處在系統(tǒng)發(fā)育樹的外圍。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析和菌株的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀，最終確定菌株L1和L2為辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。

3 結(jié)論與討論

通過對南昌市辣椒疫病樣品進(jìn)行病原菌分離，共獲得16個培養(yǎng)性狀結(jié)果一致的真菌菌株，其具有相同的形態(tài)特征和大小測量值，且與文獻(xiàn)[8,10]對辣椒疫霉的形態(tài)特征和測量值相符；隨機(jī)選取2個菌株測定其rDNA-ITS序列，結(jié)果其序列完全相同且與GenBank中辣椒疫霉的對應(yīng)序列具有99.88%的同源性；2個菌株的rDNA-ITS序列與辣椒疫霉菌在rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支；確定南昌市辣椒疫病的病原菌為辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)。