金周晟 董嬌嬌 陳鴻飛 夏芳芳

伴隨著超聲技術(shù)的發(fā)展，區(qū)域神經(jīng)阻滯在臨床手術(shù)中應(yīng)用越來越廣泛［1］，但局麻藥中毒會引起全身系統(tǒng)性毒性［2］，嚴(yán)重時可引起心律失常甚至心臟停搏等心臟毒性［3-4］。布比卡因是長效酰胺類局麻藥之一，因其麻醉效果強且術(shù)后鎮(zhèn)痛效果好，在臨床麻醉中廣泛使用，其心臟毒性也是同類酰胺類局麻藥中最強的［5］。右美托咪定是一種高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，通過α2-AR抑制神經(jīng)元放電，發(fā)揮抗交感、抗焦慮、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用［6］，在區(qū)域阻滯麻醉中廣泛應(yīng)用［7-8］。Hanci等［9］研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定預(yù)處理后能夠增強心臟對布比卡因毒性的耐受能力。另一研究發(fā)現(xiàn)α2受體激動劑可樂定預(yù)處理組發(fā)生心臟毒性癥狀時，血漿內(nèi)的布比卡因濃度比對照組高了2倍多，而心臟濃度并無差異［10］?？梢娪颐劳羞涠茉鰪娦呐K對布比卡因毒性的耐受性，但其具體機制不明。本文通過建立心肌細(xì)胞布比卡因中毒模型，研究右美托咪能增加心臟對布比卡因毒性耐受的效果及其機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 HCAEC人類冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞來源于美國ATCC細(xì)胞庫，ECM培養(yǎng)基（美國ScienCell公司），CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑（日本DOJINDO公司），各種抗體，ZO-1、PI3K、p-Akt、Akt、p-PTEN、PTEN，兔抗β-actin多克隆抗體（美國Abcam公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HCAEC人類冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（endothelial cell medium，ECM）接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待達到細(xì)胞生長對數(shù)期時分為對照組（細(xì)胞不做任何處理）；右美托咪定組（200μg/L右美托咪定作用2h）；布比卡因組（1000μM布比卡因作用2h）；右美托咪定+布比卡因組（右美托咪定和布比卡因作用2h）；右美托咪定+布比卡因+PI3K抑制劑組［右美托咪定、PI3K抑制劑LY294002（20μM）及布比卡因作用2h］。造模結(jié)束后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)基。采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測細(xì)胞活性；蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB） 檢 測Z01、PI3K、p-Akt/Akt、p-PTEN/PTEN等蛋白。

1.3 血管通透性測定 使用Transwell聚碳酸酯膜插入物培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，進行內(nèi)皮細(xì)胞通透性檢測［11］（Costar Inc.，6.5mm直徑，3μm孔隙大?。?。在Transwell裝置的上室中加入細(xì)胞懸液（2×106個細(xì)胞）。細(xì)胞融合后（通常在播種后24～48h），用無血清培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基。上室加入布比卡因或布比卡因/右美托咪定或布比卡因/右美托咪定/PI3K抑制劑LY294002。2h后，提起加入物，并攪拌下室中的培養(yǎng)基。然后用液相色譜/質(zhì)譜法測定下腔中布比卡因的濃度［12］。在一些實驗中，將單層膜與PI3K抑制劑LY294002孵育2h，然后加入布比卡因或右美托咪定。

1.4 Counting Kit-8（CCK-8）法測定細(xì)胞活力 用滅菌PBS將孔填滿至邊緣。共有100μl CCK-8的溶液添加至每個孔，37℃孵化細(xì)胞2h。用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度。Western blot檢測HCAEC人類冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞Z01、PI3K、p-Akt/Akt、p-PTEN/PTEN等血管通透性蛋白相對表達量。造模后，棄去培養(yǎng)基，加入適量的培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取劑及蛋白酶抑制劑（PMSF）（培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取劑：PMSF=100∶1配制）提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度并配置上樣蛋白。用SDS-PAGE分離膠10%，濃縮膠5%電泳，之后采用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45μm的PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1h，一抗稀釋液配制兔抗ZO-1抗體，兔抗PI3K抗體，兔抗p-Akt抗體，兔抗p-PTEN抗體和β-actin抗體（1∶1000），將膜放入相應(yīng)一抗液中4℃水平搖床孵育過夜，次日加入1∶5000的山羊抗兔IgG（H+L）HRP室溫孵1h，后加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）自動顯影讀取條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值，對于磷酸化的條帶，用一抗二抗去除液除去原先的一抗和二抗，重新封閉、分別敷兔抗Akt抗體及兔抗PTEN抗體4℃孵化過夜，重復(fù)上述后續(xù)步驟。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，采用LSD/Bonferroni進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力評估 HCAEC細(xì)胞活力在與組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.738）見表1。

表1 5組細(xì)胞活力比較（±s）

表1 5組細(xì)胞活力比較（±s）

組別 細(xì)胞活力右美托咪定組 0.94±0.04布比卡因組 0.91±0.05右美托咪定+布比卡因組 0.91±0.05右美托咪定+布比卡因+PI3K抑制劑組 0.93±0.02對照組 0.92±0.05 P值 0.738

2.2 右美托咪定增加人冠狀動脈內(nèi)皮的通透性 與未處理的內(nèi)皮細(xì)胞相比，右美托咪定的加入降低布比卡因在內(nèi)皮細(xì)胞單層的跨內(nèi)皮運輸（P=0.002）。這在加入PI3K抑制劑后逆轉(zhuǎn)。抑制劑組布比卡因濃度高于右美托咪定組（P=0.001）。同時，與布比卡因組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.751）。見表2。

表2 2h后Transwell下室中布比卡因濃度［μg/L，（±s）］

表2 2h后Transwell下室中布比卡因濃度［μg/L，（±s）］

組別布比卡因組 36±4右美托咪定+布比卡因組 26±3右美托咪定+布比卡因+PI3K抑制劑組 36±5 P值 0.002

2.3 通透性蛋白ZO-1表達 5組ZO-1蛋白的表達組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。右美托咪定組和右美托咪定+布比卡因組的ZO-1蛋白表達量高于對照組（P＜0.05），同時右美托咪定組和右美托咪定+布比卡因組ZO-1蛋白表達量高于布比卡因組（P＜0.05）。而布比卡因組與對照組ZO-1的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.109）。PI3K抑制劑組ZO-1蛋白表達與對照組表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.394）。

2.4 通路蛋白表達 5組間PI3K、p-Atk以及PTEN蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。右美托咪定組和右美托咪定+布比卡因組刺激PI3K及p-Atk蛋白表達（P＜0.05），同時布比卡因組并未增加PI3K和p-Atk蛋白表達（P=0.775）。

3 討論

在本實驗中，在布比卡因中毒背景下右美托咪定能激活PI3K/Akt通路，并且增加ZO-1蛋白的表達，降低血管對布比卡因的通透性。ZO-1是1986年發(fā)現(xiàn)的與緊密連接（TJ）相關(guān)的蛋白［13］。近年來發(fā)現(xiàn)其與調(diào)節(jié)和維持上皮籬笆和屏障功能有關(guān)。多數(shù)情況下只要ZO-1受到破壞，緊密連接功能多隨之變化，故ZO-1通常作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和通透性功能的指標(biāo)。

本實驗結(jié)果顯示，右美托咪定可以減少布比卡因透過血管壁的量。提示，右美托咪定能降低血管通透性，從而減少布比卡因從血管分布到臟器的量。同時，本實驗結(jié)果顯示，右美托咪定組與單純布比卡因組相比，ZO-1蛋白表達顯著增加，提示右美托咪定可能通過增加連接蛋白的表達從而降低血管對藥物的通透性。即右美托咪定通過增加ZO-1蛋白的表達降低血管通透性，將布比卡因“鎖”在血管內(nèi)，從而增加心臟對布比卡因毒性的耐受性。Shen等［14］在大鼠創(chuàng)傷腦模型中使用右美托咪定后，能通過降低血腦屏障通透性達到腦保護的作用，其可能機制與右美托咪定調(diào)節(jié)ZO-1蛋白有關(guān)。在腎臟缺血再灌注模型研究者得到相同的結(jié)果，右美托咪定會增加ZO-1蛋白從而對遠隔器官肺起到保護作用［15］。上述的研究結(jié)果也印證本實驗的結(jié)果。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，腦創(chuàng)傷模型抑制PI3K/Akt通路蛋白的表達，抑制ZO-1蛋白的表達［14］。而右美托咪定能逆轉(zhuǎn)這個作用，并且在加入PI3K/Akt通路抑制劑后，該作用消失。該實驗結(jié)果提示，右美托咪定通過激動PI3K/Akt通路降低血腦屏障通透性實現(xiàn)腦保護作用。Alice等［16］也研究證明，PI3K/Akt通路能增加ZO-1蛋白的表達。上述結(jié)果說明，右美托咪定可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)ZO-1蛋白從而降低血管通透性。在本實驗結(jié)果顯示，右美托咪定激活PI3K/Akt通路。這結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，然后在加入PI3K抑制劑后，右美托咪定對增加ZO-1蛋白表達的作用消失，同時右美托咪對血管通透性的改變作用也消失。這提示，在布比卡因中毒情況下，右美托咪定是通過激活PI3K/Akt通路增加ZO-1蛋白表達從而實現(xiàn)降低血管通透性。

在布比卡因中毒模型中，右美托咪定通過PI3K/Akt通路來調(diào)節(jié)ZO-1蛋白降低心臟血管通透性，最終增強心臟對布比卡因毒性的耐受性。