陳璐，何嘉文，李姝君

1開平市中心醫(yī)院，廣東開平 529300；2廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院

肺癌已成為世界各國普遍關注的公共衛(wèi)生問題[1]。據(jù)統(tǒng)計，肺癌患者數(shù)占全球癌癥患者總數(shù)的11.6%，是導致癌癥患者死亡的首要原因[2,3]。肽脯氨?；樂串悩?gòu)酶1(Pin1)是一類進化上十分保守的肽脯氨酰基順反異構(gòu)酶家族成員，最初報道于1996年，是由酵母雙雜交篩選得到且功能特異、保守的蛋白質(zhì)[4]。Pin1蛋白由163個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為18 kD。Pin1蛋白質(zhì)能特異性地催化底物蛋白質(zhì)中磷酸化的絲/蘇-脯氨酸基序(pSer/Thr-Pro)發(fā)生順式和反式間的異構(gòu)轉(zhuǎn)化，改變其性質(zhì)及亞細胞定位，進而調(diào)節(jié)底物蛋白質(zhì)磷酸化后的功能[5,6]。Pin1在細胞分化、增殖、凋亡等活動中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其功能失調(diào)可導致一系列生命活動紊亂。研究表明，Pin1異常高表達與惡性腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、白血病、乳腺癌等，表明Pin1是腫瘤診治的良好靶標[7～10]。KPT-6566是一種新型的Pin1小分子抑制劑，研究表明，KPT-6566可在體內(nèi)外抑制宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等細胞的增殖和遷移能力[11,12]。截至目前，KPT-6566對肺癌細胞的抑制作用研究鮮見報道。2019年4-11月，我們探討了KPT-6566對肺癌A549細胞增殖、侵襲、凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細胞株A549購自ATCC公司；KPT-6566藥物購自上海陶術(shù)生物科技有限公司；胎牛血清購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自BI公司；DPBS緩沖液購自索萊寶公司；兔抗Ras、Raf、MEK、ERK單克隆抗體購自CST公司；兔抗PI3K、AKT單克隆抗體購自Abcam公司；兔抗MCL-1、MYC和Pin1單克隆抗體購自ProteinTech公司；TBST緩沖液購自碧云天生物有限公司；CCK-8增殖試劑盒購自日本Dojindo公司；引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Transwell小室購自Corning公司；APC/PI雙染凋亡試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡購自德國Leica公司；細胞孵箱購自美國Thermo科技公司；超凈工作臺購自蘇州設備凈化設備廠。

1.2 A549細胞培養(yǎng)與分組 將A549細胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(常規(guī)加入雙抗：100 mg/L鏈霉素和100 kU/L青霉素)普通細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度70%～80%則擴瓶傳代培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好的A549細胞用于實驗，分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，低、中、高劑量組細胞培養(yǎng)液中分別加入終濃度為2.5、5和10 μmol/L KPT-6566溶液，對照組細胞則加入等體積的完全培養(yǎng)基。

1.3 細胞存活率測算 96孔培養(yǎng)板中接種肺癌A549細胞，數(shù)量為5×103/孔，普通細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后充分去除細胞培養(yǎng)基，分別加入對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組培養(yǎng)液，每組實驗設置3復孔，完全培養(yǎng)基組為空白組。各組細胞于培養(yǎng)箱中孵育24 h后加入CCK-8溶液，劑量為10 μL/孔，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板并借助全波長酶標儀檢測450 nm處吸光度值(OD值)，計算細胞存活率以評估癌細胞增殖能力。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 細胞克隆能力檢測 將肺癌A549細胞以2×102/孔數(shù)量接種于6孔板中，細胞貼壁后充分去除培養(yǎng)基，分別加入對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組培養(yǎng)液。細胞于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2周后用PBS緩沖液清洗3次。4%多聚甲醛固定1 h，PBS緩沖液清洗2次。結(jié)晶紫染色1 h后用PBS緩沖液充分洗滌，晾干，倒置顯微鏡下計算各組細胞克隆形成個數(shù)。

1.5 細胞侵襲能力檢測 使用DMEM培養(yǎng)基充分濕潤Transwell小室，加入50 μL Matrigel膠工作液，晃勻后置于24孔板中并放入培養(yǎng)箱中孵育0.5 h，備用。各組A549細胞以200 μL體積接種于Transwell上室，下室加入相應組別的藥物培養(yǎng)基500 μL(胎牛血清濃度為20%)，保證上下室藥物濃度一致。將培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，實驗終點時，充分去除上下室培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛溶液固定1 h后使用生理鹽水清洗3次。加入結(jié)晶紫染色液充分染色40 min，移除染色液后用棉棒輕輕拭去殘余Matrigel膠，Transwell小室于水流下充分清洗掉殘存膠和染色液，倒扣放置晾干。倒置顯微鏡下觀察并計算各組侵襲細胞數(shù)目。

1.6 細胞凋亡比例檢測 將肺癌A549細胞以5×105/孔數(shù)量接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)過夜，充分去除培養(yǎng)基后用無菌PBS溶液沖洗1次，分別加入對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組培養(yǎng)液，每組實驗設置3復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗終點時，收集各組細胞離心并用無菌PBS溶液清洗2次，每管細胞以100 μL Binding buffer重懸，按照凋亡試劑盒說明書指示，避光條件下加入PI和APC各5 μL，置于4 ℃冰箱中避光孵育0.5 h，BD流式儀檢測細胞凋亡比例。

1.7 各組細胞中Pin1、PI3K、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、GAPDH mRNA表達檢測 各組細胞培養(yǎng)1 d后，利用TRIzol溶液裂解并提取細胞總RNA，將細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并儲存于-80 ℃冰箱備用。以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列如下： Pin1正向引物為5′-TCGAGGGCCGAATTGTTTC-3′,反向引物為5′-GCTGCCGCATGAGTGTTC-3′； MCL-1正向引物為5′-CAAGAGTCCACAGACCTTTCATC-3′,反向引物為5′- TGTCACAGCACCCATGGTAT -3′；PI3K正向引物為5′-CCTCGGTGATATGGGAAAGAGA-3′,反向引物為5′-AGCCGAAACCAGCTCACTCA-3′；AKT正向引物為5′-GGCCTCAGCCCTCAGAAC-3′,反向引物為5′-TGCCACATTGCGCATAGCT-3′；MYC正向引物為5′-CACATGCCCAAGATTCACTGATAG-3′,反向引物為5′-GAGGTGGCTTGGACAGGTTAG-3′；Ras正向引物為5′-TTGTGGGACATATGCAGTGTG-3′,反向引物為5′-TCACTTCACAGCACATACTCCTA-3′；Raf正向引物為5′-TGACTCCTGTAAGGGAGAGGAAAG-3′,反向引物為5′-AGTCGCCATAAGGTTTGGAGTG-3′；MEK正向引物為5′-AGCCCACCAGCCAATGGAC-3′,反向引物為5′-TCAAGCGTCTAAGGGTTTACAAAC-3′； ERK正向引物為5′-TGCTCTGCATGTGGTAACTTG-3′,反向引物為5′-GAACCCTAGGAGCACTGACATC-3′；GAPDH正向引物為5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′,反向引物為5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。建立20 μL qRT-PCR擴增體系，包含SYBR Green溶液10 μL，10 μmol/L 的相應基因上反向引物溶液各0.8 μL，cDNA 2 μL和DEPC水6.4 μL。PCR反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。內(nèi)參基因選用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析各組細胞中Pin1、PI3K、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK mRNA的相對表達量。

1.8 各組細胞中Pin1、PI3K、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK 、GAPDH 蛋白表達檢測 收集各組KPT-6566藥物處理24 h后的A549細胞，使用無菌PBS溶液清洗2次。配制全細胞裂解液并向各組細胞中加入適量全細胞裂解液，置于冰上充分裂解20 min，12 000 r/min離心12 min后收集蛋白上清液并使用Bradford試劑盒檢測各組細胞蛋白濃度。配制相應濃度的SDS-PAGE凝膠，每個泳道加入30 μg蛋白溶液，80 V恒壓電泳約100 min，裁截合適大小的目的凝膠條帶并蓋上合適大小的PVDF膜，濕轉(zhuǎn)法250 mA恒流轉(zhuǎn)膜約100 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放置于5%脫脂牛奶溶液中封閉1.5 h，配制相應一抗溶液并將PVDF膜放置于抗體溶液中孵育過夜。TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次8 min。室溫下孵育相應的二抗溶液1.5 h，TBST溶液清洗4次，每次12 min。仔細瀝干PVDF膜并加入ECL顯影液，利用Tanon成像儀顯影。使用Image J軟件分析各組細胞蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞存活率比較 對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞培養(yǎng)24 h后細胞存活率分別為100.00%±3.34%、80.80%±4.46%、55.75%±5.98%、29.98%±1.88%，組間相比P均<0.05。

2.2 各組細胞克隆形成能力比較 對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞克隆形成個數(shù)分別為(155.33±12.76)、(123.33±12.71)、(62.00±9.90)、(28.00±9.09)個，組間相比P均<0.05。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞侵襲細胞數(shù)分別為(113.33±6.55)、(80.67±6.02)、(47.33±3.30)、(20.33±3.30)個/HP，組間相比P均<0.05。

2.4 各組細胞凋亡率比較 對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞凋亡率分別為5.81%±1.26%、14.81%±1.59%、36.04%±2.30%、63.23%±3.36%，組間相比P均<0.05。

2.5 各組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相對表達量比較 對照組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相對表達量分別為1.00±0.06、1.00±0.10、1.00±0.10、1.00±0.14、1.00±0.06、1.00±0.05、1.00±0.09、1.00±0.07、1.00±0.06，低劑量組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相對表達量分別為0.80±0.03、0.81±0.03、0.72±0.05、0.76±0.06、0.82±0.03、0.83±0.04、0.77±0.03、0.76±0.05、0.79±0.05，中劑量組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相對表達量分別為0.52±0.05、0.62±0.03、0.48±0.03、0.46±0.05、0.64±0.04、0.66±0.06、0.55±0.06、0.46±0.06、0.58±0.04，高劑量組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相對表達量分別為0.31±0.04、0.45±0.03、0.26±0.05、0.25±0.05、0.46±0.04、0.49±0.04、0.32±0.05、0.24±0.05、0.39±0.03，組間相比P均<0.05。

2.6 各組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相對表達量比較 對照組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K 蛋白相對表達量分別為1.00±0.14、1.00±0.12、1.00±0.07、1.00±0.14、1.00±0.07、1.00±0.07、1.00±0.04、1.00±0.15、1.00±0.06，低劑量組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相對表達量分別為0.72±0.04、0.80±0.02、0.77±0.06、0.71±0.04、0.78±0.03、0.82±0.03、0.75±0.05、0.76±0.04、0.79±0.03，中劑量組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相對表達量分別為0.41±0.03、0.66±0.06、0.58±0.03、0.52±0.03、0.57±0.03、0.69±0.04、0.55±0.05、0.58±0.04、0.52±0.05，高劑量組細胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相對表達量分別為0.17±0.03、0.47±0.03、0.42±0.03、0.35±0.06、0.33±0.06、0.48±0.03、0.35±0.06、0.35±0.05、0.23±0.05，組間相比P均<0.05。

3 討論

人類Pin1基因位于19號染色體，編碼的蛋白質(zhì)由163個氨基酸殘基組成，包含兩個結(jié)構(gòu)域，分別為WW(色氨酸—色氨酸)中心區(qū)和PPIase(肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶)區(qū)。WW區(qū)以兩個恒定的色氨酸為特征，可介導酶與底物識別；PPIase區(qū)包含活化位點，能夠高效地催化蛋白質(zhì)氨酰殘基N-末端的肽鍵發(fā)生順反異構(gòu)。另外，WW區(qū)與PPIase區(qū)中間由可變序列連接[13,14]。前期研究表明Pin1異常高表達于肺癌細胞，與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展密切相關，導致肺癌患者預后不良，表明靶向Pin1是拓展肺癌治療的新方向[15～17]。KPT-6566是一種新型的Pin1小分子抑制劑，以共價鍵形式結(jié)合于Pin1催化活性區(qū)-PPIase區(qū)，PPIase活性IC50為0.64 μmol/L，可介導細胞中Pin1蛋白質(zhì)發(fā)生降解[12]。本實驗結(jié)果顯示，KPT-6566抑制肺癌A549細胞中Pin1的表達水平，顯著抑制A549細胞增殖能力。研究表明，沉默Pin1可減弱腫瘤細胞克隆形成能力，增加細胞凋亡比例，阻滯癌細胞生長周期進展，抑制細胞轉(zhuǎn)移活性[18,19]，證明Pin1在惡性細胞生物學活性中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Pin1在肺癌細胞惡性生物學活性中扮演著重要的作用，其抑制劑KPT-6566可顯著抑制肺癌A549細胞克隆形成活性，增加凋亡細胞比例，減弱癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

KPT-6566可通過抑制Pin1活性從而調(diào)控肺癌細胞惡性生物學功能，但具體機制尚未明確。前期研究顯示，PI3K/AKT和MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路對細胞增殖、遷移及惡性腫瘤血管內(nèi)皮細胞的生成有重要調(diào)節(jié)作用，Pin1基因可調(diào)控腫瘤細胞中PI3K/AKT和MEK/ERK信號活性，影響PARP、MCL-1表達和DNA損傷從而調(diào)節(jié)細胞增殖活性[20]。此外，Pin1可協(xié)同激活細胞中MYC和NRF2、Raf和FOXM1活性并活化Ras/ERK/NRF2通路，調(diào)控癌細胞中線粒體功能和氧化還原穩(wěn)態(tài)，影響抗凋亡蛋白MCL-1活性并介導惡性腫瘤細胞的永生化和化療耐藥作用，促進癌細胞的發(fā)生發(fā)展，導致臨床患者預后不良[21]。與前期研究相似。

本研究發(fā)現(xiàn)，Pin1小分子抑制劑KPT-6566可抑制肺癌A549細胞中Pin1介導的PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路活性，降低MCL-1和MYC分子表達量，從而抑制癌細胞增殖和遷移等惡性生物學活性。

綜上所述，KPT-6566可阻滯肺癌細胞增殖并促進其凋亡，抑制癌細胞遷移擴散能力，其作用機制可能與Pin1調(diào)節(jié)PI3K/AKT和MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路相關。