劉路陽 杜少華 王 閃 董新新 高 鑫

（河南科技大學(xué)附屬許昌市中心醫(yī)院口腔科，許昌 461000）

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是全球第六大最常見的惡性腫瘤， 病死率約為50%，每年影響60 萬新患者，而口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占所有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌病例的絕大多數(shù)[1]?？谇击[狀細(xì)胞癌的治療方式包括外科手術(shù)和放射療法，局部復(fù)發(fā)率仍較高[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度為19 至24 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，可作為癌基因或抑癌基因調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡及血管生成情況[3]。最近研究表明，與正常細(xì)胞相比，miRNA 在口腔鱗狀細(xì)胞癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌衍生細(xì)胞系中的表達(dá)失調(diào)，表明它們在口腔癌發(fā)展中的潛在作用[4]。已有研究表明miR-98-5p 可抑制喉鱗癌Hep-2 細(xì)胞的增殖，可作為腫瘤抑制劑參與口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤進(jìn)展的調(diào)節(jié)[5-6]。但目前還沒有關(guān)于miR-98-5p對口腔鱗狀細(xì)胞癌的具體作用機(jī)制的研究，故本研究旨在探討miR-98-5p 對人舌鱗癌細(xì)胞SCC-25 凋亡和腫瘤干樣特性及裸鼠成瘤的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

Dulbecco's modified Eagle's medium 培養(yǎng)基 （12100-046）、青-鏈 霉素（15140-122）、胎牛血清（26400-036）、胰蛋白酶（15050-057）和F12培養(yǎng)基（21700-075）購自美國Gibco公司；LipoRNAi?轉(zhuǎn)染試劑（C0535）、二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（P0012）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1062S）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Anti Ki67（ab15580）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）（ab18197）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）（ab5073）購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人舌鱗癌細(xì)胞SCC-25 來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，將細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換新鮮培養(yǎng)基，1∶2 傳代。選用對數(shù)生長期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞處理與分組

取對數(shù)生長期的SCC-25 細(xì)胞1.5×105個(gè)接種于6 孔板，細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)，按LipoRNAi?轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法將mimic mock、miR-98-5p mimic、inhibitor-NC、miR-98-5p inhibitor 轉(zhuǎn) 染 至SCC-25 細(xì)胞，細(xì)胞分為control 組、mimic-mock 組、mimic組、inhibitor-NC組和inhibitor組。Control組為空白對照，僅加轉(zhuǎn)染試劑；mimic-mock組轉(zhuǎn)染mimic mock，即miR-98-5p mimic隨機(jī)打亂后的無意義的基因序列；mimic組轉(zhuǎn)染等量的miR-98-5p mimic; inhibitor-NC組 轉(zhuǎn) 染inhibitor NC；inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-98-5p inhibitor；每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.4 RT-PCR

用TRIzol 法從SCC-25 細(xì)胞中提取總RNA，用Nanodrop 分光光度計(jì)測定吸光度（A260/A280），按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 的合成和PCR 的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸30 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán); 72℃延長10 min;存儲(chǔ)在4℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。miR-98-5p 正義鏈為：5'-GGAAAATCGCCATAGCCAGG-3'，反義鏈為：5'-AGATCAGGGTGGCCCCATTT-3'；Ki67 正義鏈為：5'-GTGAGGGAATACCTTTGA-3'，反義鏈為：5'-CCTGATGGTTGAGGCTGT-3'；PCNA 正 義 鏈為：5'-TCAAGAAGGTGTTGGAGGCA-3'，反義鏈為：5'-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3'；Bax 正義鏈為：5'-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3'，反義鏈為：5'-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3'；Bcl-2 正義鏈為：5'-TCGCCCTGTGGATGACT GA-3'，反義鏈為：5'-CAGAGACAGCCAGGAGAAATC A-3'；GAPDH 正義鏈為：5'-CGCTGAGTACGTC GTGGAGTC-3'，反義鏈為：5'-GCTGAT-GATCTT GAGGCTGTTGTC-3'；以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCT方法進(jìn)行定量計(jì)算。

1.5 克隆形成法

在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至約30%融合度，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，吹散為單個(gè)細(xì)胞，用6 孔板培養(yǎng)，約5×102個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)14 d，棄掉培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定30 min，后用0.5%結(jié)晶紫染色15 min，用去離子水漂洗晾干，進(jìn)行拍照觀察。＞50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)為1 個(gè)克隆?？寺⌒纬陕?形成克隆細(xì)胞數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集懸浮細(xì)胞至10 mL 的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為3×106/mL，500 ～1 000 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1 次，500 ～ 1 000 r/min 離 心5 min，用100 μL 的 標(biāo) 記 溶 液 重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10 ～15 min，500 ～ 1 000 r/min 離心5 min，沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗 1 次，加入熒光（SA-FLOUS）溶液，4℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)

將各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)后鋪至超低黏附96 孔板。每孔100 μL F12 成球培養(yǎng)基，含10 個(gè)活細(xì)胞，各鋪10 個(gè)復(fù)孔。靜置培養(yǎng)14 d 后倒置顯微鏡下觀察成球率及成球體積。成球率=每孔細(xì)胞球數(shù)目總和/每孔加入的細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 裸鼠移植瘤模型

10 只Balb/c 裸鼠購自北京維通利華動(dòng)物科技有限公司，雄性，5 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，許可證號：SCXK（京）2015-0001，在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)。將1×106/mL 的control 組和mimic 組SCC-25 細(xì)胞懸液100 μL 分別通過皮下注射植入BALB/c 裸鼠腋窩皮下[7]，7 d 內(nèi)異種移植瘤出現(xiàn)，表示模型建立成功。

1.9 腫瘤體積及質(zhì)量

模型建立后從第3 天起每隔3 d 記錄所成瘤的長徑和短徑，體積=長徑×短徑2×1/2。在第30 天記錄下移植瘤的長徑和短徑后，斷頸法處死裸鼠，對腫瘤稱重。

1.10 免疫組織化學(xué)檢測Ki67 表達(dá)

取各組腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋制成厚度約4 μm 的切片，按免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分色，光學(xué)顯微鏡觀察Ki67在腫瘤組織中的表達(dá)情況。

1.11 免疫印跡檢測p-STAT3/STAT3 水平

收集各組細(xì)胞或腫瘤組織（100 mg），在冰上溶解25 min。以12 000 r/min 離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，用BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），在100℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE 凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4℃條件下加入相應(yīng)一抗（1：1 000）并孵育過夜，清洗，然后在4℃下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。Image J 軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究所有對比數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)表示為±s，各組間進(jìn)行比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-98-5p 表達(dá)水平

SCC-25細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-98-5p mimic/miR-98-5p inhibitor 后通過RT-PCR 檢測miR-98-5p 表達(dá)水平，結(jié)果顯示（圖1）， 與control 組相比較，mimic mock 組和inhibitor-NC 組miR-98-5p 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），mimic 組miR-98-5p 水平顯著升高（P＜0.05），inhibitor 組miR-98-5p 水平顯著降低（P＜0.05）。

圖1 SCC-25 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-98-5p mimic（A） 和inhibitor 后miR-98-5p（B）表達(dá)水平Fig 1 Expression level of miR-98-5p after transfection of SCC-25 cells with miR-98-5p mimic （A）and inhibitor（B）

2.2 miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞增殖的影響

通過克隆形成法檢測各組細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示（圖2）， 與control組相比較，mimic-mock組和inhibitor-NC 組克隆形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），mimic組克隆形成率顯著降低（P＜0.05），inhibitor 組克隆形成率顯著升高（P＜0.05）。通過RT-PCR 檢測各組細(xì)胞Ki67、PCNA mRNA水平， 結(jié)果與control 組相比較，mimic mock組和inhibitor-NC組Ki67、PCNA mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），mimic組Ki67、PCNA mRNA水平顯著降低（P＜0.05），inhibitor組Ki67、PCNA mRNA 水平顯著升高（P＜0.05） （表1）。

2.3 miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示（圖3），與control 組相比較，mimic-mock組和inhibitor-NC 組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＞0.05），mimic組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），inhibitor 組細(xì)胞凋亡 率顯著降低（P＜0.05）。通過RT-PCR檢測各組細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA水平，結(jié)果與control組相比較，mimic mock組和inhibitor-NC組Bax/Bcl-2比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），mimic組Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.05），inhibitor組Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.05）（表1）。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞克隆形成率的影響Fig 2 Effect of transfection of miR-98-5p on the clonal formation rate of SCC-25 cells

圖3 轉(zhuǎn)染miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effect of transfection miR-98-5p on apoptosis rate of SCC-25 cells

2.4 miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞成球體積和成球數(shù)目的影響

檢測各組細(xì)胞成球體積、成球數(shù)目，結(jié)果顯示與control 組相比較，mimic mock 組和inhibitor-NC 組成球體積、成球數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），mimic 組成球體積、成球數(shù)目顯著降低（P＜0.05），inhibitor 組成球體積、成球數(shù)目顯著升高（P＜0.05）（表2）。

2.5 miR-98-5p 對SCC-25 細(xì) 胞p-STAT3/STAT3 水 平的影響

通過免疫印跡檢測各組細(xì)胞STAT3 磷酸化情況，結(jié)果顯示：與control 組相比較，mimic mock組 和inhibitor-NC 組p-STAT3/STAT3 水 平 差 異 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），mimic 組p-STAT3/STAT3水 平 顯 著 降 低（P＜0.05），inhibitor 組p-STAT3/STAT3 水平顯著升高（P＜0.05）（圖4）。

表1 轉(zhuǎn)染miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞Ki67、PCNA、 Bax/Bcl-2 mRNA 水平的影響（±s）Tab1 Effects of miR-98-5p transfection on mRNA levels of Ki67， PCNA and Bax/Bcl-2 in SCC-25 cells（±s）

表1 轉(zhuǎn)染miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞Ki67、PCNA、 Bax/Bcl-2 mRNA 水平的影響（±s）Tab1 Effects of miR-98-5p transfection on mRNA levels of Ki67， PCNA and Bax/Bcl-2 in SCC-25 cells（±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Ki67 mRNA PCNA mRNA Bax/Bcl-2 Control group 1 1 1 Mimic-mock group 0.99±0.06 1.02±9.57 0.98±0.03 Mimic group 0.13±21.73* 0.17±14.03* 3.98±0.55*Inhibitor-NC group 0.98±9.41△ 0.99±7.68△ 0.97±0.06 Inhibitor group 2.24±0.26* 1.88±0.29* 0.37±0.06*

表2 轉(zhuǎn)染miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞成球體積 和成球數(shù)目的影響（±s）Tab 2 Effects of transfection of miR-98-5p on the volume and number of pellet formation of SCC-25 cells（±s）

表2 轉(zhuǎn)染miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞成球體積 和成球數(shù)目的影響（±s）Tab 2 Effects of transfection of miR-98-5p on the volume and number of pellet formation of SCC-25 cells（±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Ball volume （μm3） Ball number/100 cells Control group 48.66±5.06 42.09±6.52 Mimic-mock group 52.47±6.85 44.15±4.07 Mimic group 13.58±3.93* 9.84±2.13*Inhibitor-NC group 55.28±7.62 45.26±6.66 Inhibitor group 148.29±21.04* 82.13±9.33*

2.6 miR-98-5p 調(diào)控移植瘤裸鼠模型生長

檢測移植瘤裸鼠模型腫瘤質(zhì)量結(jié)果如圖5A、5B 所示，與control 組相比較，mimic 組腫瘤質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；檢測移植瘤裸鼠模型腫瘤體積結(jié)果如圖5C 所示，與control 組相比較，mimic組腫瘤體積顯著降低（P＜0.05）；免疫組織化學(xué)檢測Ki67 表達(dá)結(jié)果如圖5E 所示，與control 組相比較，mimic 組Ki67 陽性表達(dá)率顯著降低（P＜0.05）；免疫印跡檢測各組細(xì)胞STAT3 磷酸化情況結(jié)果如圖5F 所示，與control 組相比較，mimic 組p-STAT3/STAT3 水平顯著降低（P＜0.05）。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-98-5p 對SCC-25 細(xì)胞p-STAT3/STAT3 水平的影響Fig 4 Effects of miR-98-5p transfection on p-STAT3 /STAT3 levels in SCC-25 cells

圖5 miR-98-5p 對移植瘤裸鼠模型的影響Fig 5 Effect of miR-98-5p on transplanted tumor nude mouse model

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療多以外科手術(shù)為主，但因其易向頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且侵襲力較強(qiáng)，5 年生存率約60%[8]。近年來，已經(jīng)探索了許多新穎的生物標(biāo)記物有效用于口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床應(yīng)用，其中包括microRNA。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-98-5p，研究miR-98-5p 表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對SCC-25 細(xì)胞的影響。

細(xì)胞增殖率的改變是腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志之一，因此，評估這一特征可能有助于預(yù)測患者的預(yù)后[9]。PCNA 是一種核蛋白，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志，可精確反映細(xì)胞增殖和DNA 合成的速率。Ki67 是增殖細(xì)胞核相關(guān)抗原，相關(guān)研究表明，表達(dá)較高Ki67 的腫瘤預(yù)后較差，與腫瘤大小、血管浸潤和惡性腫瘤的其他生物學(xué)行為密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，miR-98-5p 表達(dá)升高具有降低SCC-25 細(xì)胞克隆形成率和Ki67、PCNA mRNA 水平及裸鼠移植瘤Ki67 陽性表達(dá)率，降低移植瘤裸鼠模型腫瘤質(zhì)量、體積的作用，提示miR-98-5p 可抑制SCC-25細(xì)胞增殖，抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤的生長。

細(xì)胞凋亡受阻是惡性腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制，提高細(xì)胞凋亡率是阻止癌癥發(fā)展的有效方法[11]。Bcl-2 和Bax 分別是Bcl-2 家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，在腫瘤細(xì)胞凋亡中具有重要的調(diào)控作用[12]。Bcl-2 與Bax 的比值作為檢測細(xì)胞凋亡的常用指標(biāo)，Bax/Bcl-2 比值的增加意味著凋亡被促進(jìn)。Wang 等[13]報(bào)道m(xù)iR-98-5p 表達(dá)升高，顯著誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，miR-98-5p 表達(dá)升高，具有升高SCC-25 細(xì)胞凋亡率和Bax/Bcl-2 比值的作用，提示miR-98-5p 可促進(jìn)SCC-25 細(xì)胞凋亡。

各類惡性腫瘤中含有腫瘤干細(xì)胞亞群，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，這使得腫瘤干細(xì)胞能夠重構(gòu)原發(fā)性腫瘤組織的細(xì)胞異質(zhì)性[14]。目前已有大量的研究證實(shí)了miRNAs 在多種腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。Yu 等[15]報(bào)道抑制miR- 204 可促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞增殖、EMT 性狀和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Ghosh 等[16]報(bào)道m(xù)iRNAs 主要通過調(diào)節(jié)口腔鱗癌中的腫瘤干細(xì)胞和EMT 在順鉑耐藥性中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，miR-98-5p表達(dá)升高，具有降低SCC-25 細(xì)胞成球體積、成球數(shù)目的作用，提示miR-98-5p 可抑制SCC-25 細(xì)胞干樣細(xì)胞自我更新能力。

STAT3 持續(xù)活化及異常高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)。STAT3 異常表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]。劉慧琳等[18]研究顯示miR-98-5p 通過下調(diào)STAT3 表達(dá)，抑制A549 細(xì)胞增殖和侵襲能力，同時(shí)促進(jìn)A549 細(xì)胞凋亡。Liu 等[19]研究顯示microRNA-98 通過靶向STAT3抑制鼻咽癌中的細(xì)胞增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中miR-98-5p表達(dá)升高，均具有降低p-STAT3/STAT3水平的作用，提示miR-98-5p可抑制SCC-25細(xì)胞和裸鼠腫瘤組織STAT3磷酸化。

綜上所述，miR-98-5p表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)SCC-25細(xì)胞凋亡，抑制增殖、干細(xì)胞自我更新能力。這可能是通過抑制STAT3磷酸化實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示miR-98-5p在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，為后續(xù)研究提供了前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，可作為診斷及治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在生物學(xué)指標(biāo)。