王智 王娟 趙東明

[摘要]目的：探討黃芩苷對異丙腎上腺素誘導(dǎo)心力衰竭大鼠心室重構(gòu)及心室肌凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、纖維化的影響。方法：將40只清潔級雄性Wistar大鼠分為對照組、黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組，各8只，共干預(yù)28d;多普勒超聲檢測大鼠LVEF%、LVPWd及LVEDd變化;ELISA法檢測血清中NTpro-BNP及ST水平，采用TUNEL及Masson染色檢測心室肌細(xì)胞凋亡及纖維化情況;Westernblot法檢測心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1、Smad7蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組比較，模型組LVEF%、LVPWd降低，LVIDd升高，血清ST2、NT-proBNP水平及心室肌細(xì)胞中AI值、CVF、GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達(dá)升高，Smad7表達(dá)降低（P<0.001）;與模型組比較，黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組心室重構(gòu)改善，血清T2、NT-proBNP水平及心室肌細(xì)胞中AI值、CVF、GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達(dá)降低，Smad7表達(dá)升高，且呈劑量依賴性（P<0.001）。結(jié)論：黃芩苷可能通過抑制ERS及TGF-β1/Smad7信號通路，起到減少心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌纖維化，從而起到逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心力衰竭的作用。

[關(guān)鍵詞]黃芩苷;心力衰竭;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;凋亡;纖維化

[中圖分類號]R542.23;R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2096-5249（2021）17-0011-02

黃芩在中藥歸類中，歸屬清熱瀉火類藥物，但近年來大量研究證實，黃芩中的有效提取物——黃芩苷對多種原因造成的心肌細(xì)胞損傷有明確效果[1-2]。異丙腎上腺素（ISO）是制備心力衰竭大鼠模型的經(jīng)典藥物，通過激動β受體，促使心率加快，使心臟長期處于相對缺血環(huán)境，最終引發(fā)心力衰竭[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）本為真核細(xì)胞的一種自我保護機制，可降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白，而長期或強度過高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使細(xì)胞自身難以將錯誤折疊蛋白全部降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而抑制ERS，減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量也是目前心力衰竭的研究熱點和新方向[4]。本研究通過ISO建立心力衰竭大鼠模型，應(yīng)用不同劑量黃芩苷進行干預(yù)，觀察心力衰竭大鼠心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡、ERS及纖維化發(fā)生情況。

1材料與方法

1.1實驗藥品及試劑黃芩苷（江北藥業(yè)，純度≥98%）;TUNEL試劑盒（翊圣生物科技有限公司）;ST2、BNP試劑盒（北京六一公司）;GRP78、IRE1、CHOP、山羊抗兔二抗單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。5180/R型離心機（德國Eppendorf公司）;WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）;ChemDocXRS型化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Bio-red公司）。MK3型酶標(biāo)儀（美國Multiskan公司）;GEVividE9彩色超聲（美國GE公司）。

1.2心力衰竭模型大鼠制備與分組40只清潔級雄性Wistar大鼠，體重（200±15）g，隨機分為對照組、模型組、黃芩苷低、中、高劑量組卡托普利組，每組各8只。對照組外，其余大鼠均根據(jù)文獻(xiàn)[5]制備心力衰竭模。黃芩苷組低、中、高劑量組分別給予黃芩苷25、50、100mg/kg·d灌胃，卡托普利組給予卡托普利50mg/kg·d灌胃[6]，對照組每天給予等體積生理鹽水灌胃，每組均連續(xù)給藥28d。

1.3多普勒心臟超聲檢測于實驗第28d將大鼠麻醉，脫毛膏退去胸前毛發(fā)，應(yīng)用皮膚探頭對大鼠進行心功能檢測，記錄并比較各組大鼠LVEF%、LVPWd及LVEDd情況。

1.4血清ST2、NT-proBNP水平檢測各組大鼠進行腹主動脈抽血，并處死，2000r/min條件下分離血清，采用ELISA法對ST2、NT-proBNP進行檢測，嚴(yán)照說明書操作。

1.5TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡情況處死大鼠后使用眼科剪子取心室部分組織，經(jīng)脫水、固定、TUNEL染色后放入恒溫箱進行孵育，沖洗3次后進行封片。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察鏡下凋亡細(xì)胞，褐色代表已凋亡細(xì)胞，藍(lán)色代表仍生存細(xì)胞，于200倍鏡下觀察各組大鼠心室肌細(xì)胞凋亡情況，凋亡指數(shù)（AI）=各視野陽性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞總數(shù)×100%，實驗獨立重復(fù)3次。

1.6Masson染色將各組大鼠心室肌組織投入至固定液中，經(jīng)脫水、固定后，置于切片機中連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、二甲苯透明后進行Masson染色。染色后用ImageJ5.0圖像分析軟件鏡下組織膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）分析進行統(tǒng)計，實驗獨立重復(fù)3次。

1.7Westernblot法檢測ERS及纖維化信號通路蛋白將大鼠部分心室加入液氮，冷研磨后制備10%組織勻漿，根據(jù)文獻(xiàn)[7]進行操作，GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1、Smad7單克隆抗體比例分別為1：800、1：1000、1：800、1：1000、1：1000，后經(jīng)暗室曝光，掃描膠片，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析，實驗獨立重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件，計量資料以x±s表示，多組間比較數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1多普勒超聲結(jié)果超聲結(jié)果顯示，模型組較對照組LVEF%、LVPWd降低，LVIDd升高（t=-11.16，t=-12.76，t=24.58，均P<0.001）;黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組較模型組LVEF%、LVPWd升高，LVIDd降低;且隨黃芩苷劑量升高上述指標(biāo)改善趨勢更加明顯（P<0.001），詳見表1。

2.2血清ST2、NT-proBNP檢測結(jié)果結(jié)果顯示，模型組較對照組ST2、NT-proBNP水平升高（t=8.8，t=21.3，P<0.001）;黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組較模型組ST2、NT-proBNP水平降低，且隨黃芩苷劑量升高而降低（P<0.001），詳見表2。

2.3TUNEL染色結(jié)果結(jié)果顯示，模型組（8.49±3.97）較對照組（3.66±0.19）AI值升高（P<0.001）;黃芩苷低（29.87±5.69）、中（25.4±2.66）、高劑量組（15.13±1.55）及卡托普利組（15.47±0.76）較模型組AI值降低，且隨黃芩苷劑量升高而降低（F=94.36，P<0.001）。

2.4Masson染色結(jié)果結(jié)果顯示，模型組（26.47±1.82）較對照組（2.37±0.49）CVF升高（t=22.15，P<0.001）;黃芩苷低（18.57±1.93）、中（12.37±1.43）、高劑量組（7.23±0.91）及卡托普利組（7.2±0.85）較模型組CVF降低，且隨劑量的升高而降低（F=74.66，P<0.001）。

2.5ERS信號通路蛋白檢測結(jié)果結(jié)果顯示，模型組大鼠心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達(dá)較對照組升高，Smad7較對照組降低（t=6.19，t=14.82，t=24.98，t=17.44，t=-15.14，均P<0.001）;黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組較模型組GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達(dá)降低，Smad7表達(dá)升高;且隨黃芩苷劑量升高改變趨勢越加明顯（P<0.001），詳見圖1、表3。

3討論

心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心室重構(gòu)的重要原因，而心室重構(gòu)又是心力衰竭的病理基礎(chǔ)，因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡及纖維化是逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心力衰竭的新方向[8-9]。黃芩苷對不同心血管疾病的作用已在心血管領(lǐng)域成為研究熱門，有潛質(zhì)成為治療或輔助治療多種心血管疾病的有效藥物[10]。

本團隊在前期研究中證實[2]，黃芩苷可通過抑制線粒體凋亡信號通路，降低膿毒血癥損傷心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量。黃芩苷對于ISO誘發(fā)心力衰竭心肌保護作用鮮有報道，本團隊通過，頸部后皮下注射ISO進行心力衰竭模型大鼠造模，進而采用不同濃度黃芩苷進行干預(yù)，并使用卡托普利作為陽性對照藥物，觀察黃芩苷對心力衰竭大鼠心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡、纖維化的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度黃芩苷干預(yù)治療后，大鼠LVEF%、LVPWd升高，LVIDd降低，且血清中心衰標(biāo)物ST2、NTpro-BNP均降低，且隨劑量增高改善趨勢愈加明顯，從形態(tài)學(xué)與血清標(biāo)記物角度說明心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)在一定程度上被逆轉(zhuǎn)，心力衰竭有所改善，存在劑量依賴性。TUNEL及Masson染色實驗結(jié)果證實，心力衰竭模型大鼠

心室肌組織存在較為嚴(yán)重的纖維化和細(xì)胞凋亡，而經(jīng)黃芩苷干預(yù)治療后，心室肌組織AI值及CVF均降低，且隨劑量的增加而降低，說明黃芩苷逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)可能是通過抑制心肌細(xì)胞凋亡和抑制纖維化實現(xiàn)的。

目前，研究已證實持續(xù)而強烈的ERS是引起的ISO心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的重要因素[11]。TGF-β1是目前已知的能導(dǎo)致大部分器官發(fā)生纖維化的細(xì)胞因子，其可能通過過表達(dá)Smads相關(guān)蛋白加重組織或器官纖維化，而Smads7是Smads家族蛋白的抑制受體，當(dāng)Smads7低表達(dá)時，則可能導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[12]。為了探究黃芩苷抑制心肌細(xì)胞凋亡和纖維化的深層機制，本團隊對心室肌組織ERS和TGF-β1/Smads7纖維化信號通過進行檢測。結(jié)果證實，心力衰竭大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1呈高表達(dá)，Smad7呈低表達(dá)，說明心力衰竭大鼠心室肌組織存在ERS引起的凋亡和TGF-β1/Smads7引起的纖維化。而經(jīng)黃芩苷干預(yù)治療后，GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達(dá)降低，Smad7表達(dá)升高，且黃芩苷劑量升高改變趨勢越加明顯，說明黃芩苷可能通過阻斷ERS和TGF-β1/Smads7信號通路，起到抑制心室肌細(xì)胞凋亡及纖維化作用，進而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心力衰竭的作用。

綜上所述，黃芩苷可能通過抑制GRP78/IRE1/CHOP及TGF-β1/Smad7信號通路，起到減少心肌細(xì)胞ERS凋亡，抑制心肌纖維化，從而起到逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心力衰竭的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]王賽，胡燁，包斯圖.黃芩苷對擴張型心肌病大鼠心室重構(gòu)、心室肌細(xì)胞凋亡及β-AR/PKA/CaMKII信號通路的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，24（6）：1-5.

[2]王智，王娟，包斯圖，等.黃芩苷對酯多糖損傷AC16心肌細(xì)胞的保護作用及機制研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2019，31（3）：428-433.

[3]秦瑞麗，董志強，張昕，等.異丙腎上腺素制作大鼠心力衰竭惡病質(zhì)模型及心功能和營養(yǎng)指標(biāo)的變化[J].中國老年學(xué)雜志，2020，40（14）：3081-3048.

[4]劉忠勇，李林，方家.真武湯對心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡、纖維化的影響[J].中醫(yī)雜志，2017，58（14）：1218-1223.

[5] Dai HL， Zhang XJ， Yang ZG， et al. Effects of Baicalin on blood pressure and left ventricular remodeling in rats with renovascular hypertension[J]. Med Sci Monit， 2017， 23（17）： 2923-2948.

[6]王賽，宋小爭，鄭玲玲，等.卡托普利對異丙腎上腺素所致心力衰竭大鼠心室重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、PLGF的影響[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2018，17（1）：18-22.

[7]楊禹晗，陳超英，袁占鵬.玉竹提取物對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷及凋亡的保護作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，24（16）：136-140.

[8]賀智慧，邵立群，宣麗穎，等.黃芪注射液對阿霉素性心肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與縫隙連接蛋白表達(dá)的影響[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2018，34（2）：159-163.

[9]殷云杰，陳燕春，楊松.心肌纖維化機制研究進展[J].中華老年多器官疾病雜志，2019，18（7）：540-543.

[10]肖意川，張許，柯培雄，等.黃芩苷在心血管疾病中的藥理作用研究新進展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2018，39（24）：3587-3590.

[11]安琪，徐富剛，劉勇，等.丹參對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2020，41（2）：1-5.

[12]易嘉莉，聶連桂，李亞靈，等.尖葉假龍膽通過調(diào)控TGF-β1/Smads7信號抑制ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的研究[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報，2020，35（5）：1-5.

基金項目：吉林省中醫(yī)藥科技普通資助項目（編號：2019126）

*通信作者：王智（1983-），男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：冠心病發(fā)病機制及藥物治療研究。

（收稿日期：2021-3-11 接受日期：2021-4-27）