Wnt/β-catenin信號通路調控聽覺系統的研究進展

許應鵬 孫晨 李琦

南京市兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科(南京210008)

WHO統計數據顯示全球超過5%的人口，約4.66億人有聽力損失，到2050年，將有超過9億人患有聽力損失性疾病，如何改善聽力損失成為亟待解決的問題。Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路的經典途徑，通過β-catenin,TCF兩個關鍵調節(jié)因子，從轉錄水平上影響相關的靶基因的表達來調控機體的生長發(fā)育，廣泛的參與各種疾病，包括退行性疾病，代謝性疾病和癌癥的發(fā)生，發(fā)展，與聽覺系統疾病也有著密切的關系，是解決聽覺疾病的新靶點。本文總結了Wnt/β-catenin信號通路調控聽覺系統的最新研究進展，為聽力疾病的分子生物學機制研究與臨床治療提供理論基礎。

1 Wnt/β-catenin信號通路

當Wnt信號存在時，Wnt蛋白與細胞膜上卷曲蛋白受體（Frizzled receptor，Fz）結合，引起脂蛋白受體相關蛋白5/6（LDL-receptor-relatedprotein 5/6，LRP5/6）磷酸化和Fz-LRP5/6復合物的形成，磷酸化的LRP5/6與Axin蛋白親和，Axin上結合的糖原合酶激酶 3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3），絡氨酸激酶1（Casein kinase 1，CK1）磷酸化LRP5/6,進一步促進LRP5/6與Axin的結合。通過DEP和PDZ結構域，蓬亂蛋白（Dishevelle，Dvl）與Fz結合，Dvl和Axin擁有相同的DIX結構域，形成的多聚體能夠促進Wnt-Fz-LRP5/6復合物的形成，β-catenin降解復合物的解體[2]。另一方面，Wnt與Fz結合，激活細胞膜內側的CK1，激活的CK1磷酸化Dvl，釋放GSK3β 結合蛋白（GSK3β binding protein，GBP），GBP能夠識別并結合GSK3β，抑制GSK3β磷酸激酶活性，阻止β-catenin階梯磷酸化。因此，當Wnt信號存在時，Wnt受體復合物的形成促進降解復合物的解體，導致β-catenin的積聚。

β-catenin在胞質中積聚，在多種酶的共同作用被轉運到細胞核內，進入細胞核內的β-catenin通過直接結合一個低親和力的N端重合位點替代Groucho/TLE等抑制性因子與Tcf/Lef結合，激活轉錄復合物。

2 Wnt/β-catenin信號通路通調控聽力疾病機制

2.1 Wnt/β-catenin信號通路調控聽力系統發(fā)育

Wnt信號是胚胎發(fā)育的標志，在胚胎發(fā)育的不同階段承擔著不同的作用，在聽力系統中參與耳的結構特異性發(fā)生，前庭結構的形成和耳蝸的發(fā)育。在胚胎發(fā)育的神經發(fā)生期，外胚層在周圍信號的影響下異化成耳基板，耳基板內陷融合形成充滿液體的聽囊，神經母細胞從囊泡中分離到外胚層附近，最終成為前庭和耳蝸（螺旋）顱神經節(jié)。同時，囊泡的單純上皮通過定向生長，上皮融合和程序性細胞死亡的局灶性熱點被雕刻成一組腔室和導管[3]。鄰近的間充質組織包繞上皮形成封閉的液腔，這些腔室和神經節(jié)被軟骨膜包繞保護，軟骨膜最終骨化形成內耳結構[4]。

早期胚胎發(fā)育過程中，Wnt對前后體軸的形成非常重要，能夠同時抑制胚胎前化，促進胚胎后化。來自相鄰后腦的高Wnt信號能夠促進耳廓上裂（otic-epibranchial placode，OEP）向耳的分化，低Wnt和高成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGF）信號將這種分化限制在OEP的外側[5]。當耳基板內陷形成耳蝸囊泡時，Wnt和Shh信號通過調控靶基因Dlx5/6，Hmx2/3和Gbx2在大鼠背腹軸的建立上發(fā)揮著重要作用，,這些基因促進了前庭系統內淋巴管和半規(guī)管的形成[6]。

Wnt在胚胎耳蝸發(fā)育作用在三個潛在的窗口期：在小鼠胚胎日（embryonic day，E）12.5Wnt激活促進祖細胞增殖；在E13.5Wnt信號通路通過調控Fgf20信號通路促進退出細胞周期的前感覺細胞中Sox2的表達；Wnt信號通路的激活還促進了耳蝸毛細胞的形成，并且在胚胎發(fā)育和新生早期重新編程支持細胞重新進入細胞周期，分化為毛細胞。

在E12.5，祖細胞仍在進行增殖，通過LiCl激活Wnt通路在體外實驗中能夠極大的擴展Sox2的增殖域[4]。成年小鼠海馬區(qū)的研究揭示了Notch結構域能夠結合sox 2啟動子上的rbpj結合位點，提示Notch可以直接激活sox 2轉錄。Wnt能夠在癌細胞中增強Notch信號[7]，類似的在早期發(fā)育過程中，Wnt還通過上調Notch通路中Jagged 1的表達，在耳基板的形成過程中增強Notch信號[8]，這些研究表明，Wnt確實可以提高Notch早期的作用，增強Sox 2的表達，促進祖細胞增殖，但我們也不排除Wnt可能對Sox 2的調控有更直接的影響，這需要等待進一步的發(fā)現。

發(fā)育中的耳蝸在E13.5進入終末有絲分裂期，Sox2水平的小幅升高能夠觸發(fā)小鼠胚胎干細胞的分化，但Sox2的過表達和wnt/β-catenin的強制激活阻止了前感覺細胞的完全分化。前感覺細胞向毛細胞的分化呈現明顯的Sox2濃度依賴性，通過與atoh1增強子區(qū)的結合，Sox 2直接激活atoh 1，在體外[9]和體內[10]誘導異位聽覺毛細胞的產生。隨后Sox2表達的減少對于毛細胞成熟是必要的，因為高水平的Sox2會激活Atoh 1的抑制子，維持支持細胞的命運[11]。Sox 2是毛細胞增殖分化所必需的，高濃度的Sox2又抑制了毛細胞的分化，因此它與毛細胞形成的關系被認為是一種“非相干前饋回路”[12]。Wnt可能與Notch一起參與促進FGF 20介導的Sox 2濃度在有絲分裂后耳蝸內的升高抑制分化。Wnt活化促進了早期神經前體細胞基因的表達，雖然尚不清楚這是通過Sox 2發(fā)生的，還是獨立發(fā)生的，但有一些初步證據表明，β-catenin通過與前感覺細胞中的3’增強子區(qū)域相互作用而上調了Atoh 1[6]。由此可見，Wnt能夠通過Notch、FGF20等不同途徑，間接或直接的參與到不同階段細胞命運的抉擇。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路對聽覺細胞的保護作用

2.2.1 Wnt/β-catenin信號與遺傳性耳聾

聽力損失是人類最常見的神經感覺障礙之一，超過50%的聽力損失是遺傳性耳聾造成的，以常染色體隱性遺傳為主的遺傳性耳聾占遺傳性耳聾75%-80%，超過60個基因與常染色體隱性耳聾相關[13]。70%的遺傳性耳聾是非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL），表現為孤立性的聽力損失，不伴隨其他相關臨床癥狀。

哺乳動物內耳發(fā)育期間，Wnt/β-catenin信號通路誘導囊泡發(fā)生，指導前庭器官的形成，在耳蝸毛細胞發(fā)育中也起著重要作用。低脊椎動物的研究顯示，Wnt信號通路與支持細胞的增殖、毛細胞維持和再生有關，脂蛋白受體相關蛋白5（LDL-receptor-relatedprotein 5，LRP5）缺乏對Wnt信號通路的抑制可能導致聽力損失[14]。通過對一個中國非綜合征感音神經性耳聾家系進行全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES），尋找在Wnt信號通路中起重要作用的致病基因LRP5。LRP5基因由22個內含子和23個外顯子組成，位于11q13染色體上。LRP5蛋白是調控Wnt信號通路的膜結合的Wnt受體，通過四個重復的β螺旋/表皮生長因子（β-propeller/epidermal growth factor，EGF)重復序列結構域與Wnt配體結合[1]。在NSHL家系發(fā)現的LRP5的純合錯義突變下調β-catenin和Lef-1的表達，抑制下游增殖基因的表達。LRP5基因敲除直接影響Wnt信號通路相關基因的表達，導致毛細胞和支持細胞增殖減少，毛細胞和支持細胞數量減少，最終導致聽力下降[16]。LRP 5突變通過Wnt信號通路導致聽力損失的發(fā)現能夠幫助科學家更多地了解耳聾的發(fā)病機制，并找到更多的預防和治療耳聾的方法。

2.2.2 Wnt/β-catenin信號通路與年齡相關性聾

衰老是一種自然現象，伴隨著生理功能的逐漸退化和疾病的易感性增加。年齡相關性聽力損失（age-related hearing loss,AHL）是由衰老引起的普遍的感覺神經性聽力障礙，以聽聲音和理解語音的能力降低，對聲音信息的中央處理能力降低以及定位聲源的能力降低為主要癥狀[17]。中心聽覺系統的年齡相關退化會影響語音理解和聲源定位，越來越多的證據表明，隨著年齡的增長，中樞聽覺系統的退化在老年性耳聾的發(fā)病過程中起著關鍵作用[18]。

研究發(fā)現Wnt/β-catenin通路參與某些衰老相關疾病，例如β-catenin的表達減少與年齡相關的骨質疏松癥有關[19]，功能失調的Wnt信號轉導也與阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s disease，AD）的發(fā)生有關：降低β-catenin的表達提高了AD祖細胞中神經損害的發(fā)生，而高表達的β-catenin能夠通過降低β-淀粉樣蛋白的毒性提供神經元保護[20]。動物研究表明，伴隨著Wnt/β-catenin信號通路的表達降低，D-gal模型鼠和老年大鼠在聽覺皮質中表現出更多的神經元凋亡和神經變性。可見Wnt/βcatenin信號的異常調控會使聽覺皮層神經元對凋亡敏感，進而導致神經變性。有趣的是，通過長期的Licl治療誘導的Wnt/b-catenin信號通路的激活逆轉了D-gal誘導的神經退行性變，這些可能是通過調節(jié)B淋巴瘤Mo-MLV插入區(qū)1（B lymphoma Mo-MLV insertion region 1，BMI1）的表達而發(fā)生的[21]。典型的Wnt信號參與了聽覺器官的發(fā)育和聽覺系統功能的維持，這些發(fā)現為Wnt/β-catenin信號通路對老年性聽皮層變性的保護作用提供了新的證據，為老年性耳聾的治療提供了潛在的方向。

2.2.3 Wnt/β-catenn信號通路與藥物性聾

哺乳動物的聽覺細胞有許多線粒體，呈現高耗氧量特點，這使得它們對氧化應激非常敏感，特別是當受到噪音或耳毒性藥物的刺激時，細胞內ROS積聚，線粒體釋放細胞色素能夠很快引起細胞凋亡[22]；一些藥物如順鉑還會形成水性復合物聚積導致DNA損傷和交叉結合，激活caspase3誘導的凋亡；促炎癥因子TNF-α,IL-β，IL-6和NF-kb的釋放也會導致促凋亡因子的激活[23]。如何減少耳毒性藥物對聽力的影響是當前研究的一個方向。

Wnt通路的促存活活性在許多組織中報道，并被認為是通過誘導特異性抗凋亡基因介導的。例如，在視網膜神經節(jié)細胞中Wnt激活通過增加包括NT3、BDNF和NGF在內的保護性生長因子的表達來減少細胞凋亡[24]。在耳蝸細胞中，Wnt通路也發(fā)揮著類似的作用，通過GSK3β抑制劑預處理的HEI-OC1耳蝸毛細胞系在經過新霉素[25]、順鉑[26]處理過后較對照組細胞凋亡明顯減少。研究發(fā)現，新霉素、順鉑等耳毒性藥物造成了HEI-OC1毛細胞中β-catenin磷酸化的增加，Wnt通路激活后抑制了順鉑誘導的P53的磷酸化，降低了炎性因子NF-kb,TNF-α,IL-6的表達，積聚的β-catenin有可能直接參與了NF-kb的調控，但具體機制仍待進一步研究，但毫無疑問的是激活的Wnt通路能夠保護毛細胞，降低藥物的耳毒性。

2.3 Wnt/β-catenin信號通路調控聽覺細胞再生

感音神經性耳聾常由于過度刺激、耳毒性藥物、感染、自身免疫性疾病或老化引起的耳蝸毛細胞退化引起[27]。非哺乳動物斑馬魚和雞中，活躍的Wnt信號通路可以促進受損的耳蝸毛細胞增殖和再生，而哺乳動物中這種損害往往是不可逆的，丟失的聽覺毛細胞在哺乳動物中不能自發(fā)地被替換，再生可能受限于Lgr5（leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5）和Axin2陽性的祖細胞[28]，但內耳干細胞、基因治療和信號轉導基因工程等技術的發(fā)展為聽覺細胞的再生研究提供了條件。

Lgr5是wnt信號通路的下游靶基因，在多種組織中標記成體干細胞，廣泛存在于胚胎和新生小鼠耳蝸[5]。Lgr5+細胞具有自我更新，增殖和再生耳蝸毛細胞的能力，在體內外實驗中，均能夠作為耳蝸毛細胞的祖細胞。在毛細胞損傷的情況下，激活Wnt通路，增加Lgr5的表達，能夠誘導Lgr5+的內柱細胞和第三排Deiters細胞增殖并分化為新生的耳蝸內毛細胞，但在未損傷的成人耳蝸中，這種誘導并沒有發(fā)生[2]。與Lgr5類似，Axin2也是wnt通路的下游靶基因，主要在哺乳動物耳蝸鼓室邊緣細胞中表達[3]。新生兒耳蝸中，位于感覺上皮下方的Axin2+鼓室邊界細胞在體外具有增殖和再生潛力，在wnt激活劑存在的情況下，這些細胞迅速進入增殖狀態(tài)，分化為毛細胞和支持細胞[30]。因此，活化的Wnt信號影響新生耳蝸中Lgr5+祖細胞和Axin2+耳蝸鼓室邊緣細胞的增殖和再生。

Atoh1，一種基本的螺旋環(huán)螺旋轉錄因子，在上皮細胞和神經細胞類型的分化中起著至關重要的作用，是毛細胞發(fā)育的關鍵調節(jié)因子。Atoh1敲除的小鼠缺乏許多腸道上皮細胞類型，小腦和脊髓神經元發(fā)育不完全，內耳毛細胞完全缺乏[31]。Atoh1對于在毛細胞受損母體內產生新生毛細胞是必須且充足的，過表達的Atoh1誘導非感覺細胞分化為毛細胞，新生的內毛細胞形態(tài)正常，能夠發(fā)揮功能，明顯改善母體聽力閾[26]。Wnt通路可以提高Atoh1的表達，通過與Atoh1的3’增強子內的Tcf-Lef位點相互作用，促進Atoh1的轉錄，Notch信號調節(jié)Atoh1表達的作用也依賴于β-catenin的作用[31]。Atoh1在耳蝸內誘導非感覺細胞分化為新生毛細胞的能力使得Atoh1恢復毛細胞的作用機制和臨床應用成為當前研究的熱點。

3 結語

Wnt/β-catenin信號通路在聽力系統發(fā)育的各個階段發(fā)揮著不可代替的作用，在胚胎發(fā)育階段Wnt/β-catenin信號通路能夠促進聽覺器官的形成、祖細胞的增殖、毛細胞的增殖和分化，異常表達常見于以非綜合征性耳聾為主的常染色體遺傳性耳聾。Wnt/β-catenin信號通路維持著聽覺系統的正常運作，能夠保護聽覺細胞，提高聽覺細胞的抗氧化能力，進一步的，Wnt/β-catenin信號通路能夠通過降低積聚在神經細胞的β-淀粉樣蛋白的毒性來提供神經元保護。得益于非哺乳動物中發(fā)現的Wnt/β-catenin通路對聽覺細胞干細胞特性的激活作用，對于難以逆轉的毛細胞損傷的恢復也不再是難以觸及。Wnt/β-catenin信號通路為治療相關耳聾性疾病提供多個作用位點，使聽力損失的治療方法有了長足的發(fā)展并獲得階段性的成果，而如何讓治療走向臨床是我們下一步需要思考的問題。