王 東， 張亞臣， 唐 勇， 相 銀， 田 丁

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200082

2013年《成人降膽固醇治療降低動脈粥樣硬化性心血管疾病風(fēng)險指南》[1]指出，動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)是多種危險因素長期作用的結(jié)果，其中已明確的危險因素包括年齡、高血壓病史、血脂異常、血糖升高等，高膽固醇水平是冠心病的核心致病危險因素，已得到動物實驗、流行病學(xué)調(diào)查及循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)支持。2016年《中國成人血脂異常防治指南》[2]指出，降低機(jī)體膽固醇水平，尤其是低密度脂蛋白水平，可顯著降低患ASCVD的風(fēng)險，并仍建議首選降脂藥物為他汀類藥物。但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，部分患者服用他汀類藥物后出現(xiàn)肝功能損害、血糖升高等不良反應(yīng)[1]，這些不良反應(yīng)的出現(xiàn)反而增加了機(jī)體患ASCVD的風(fēng)險，故這類患者更需要安全的降脂藥物。

人前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)抑制劑近年來被證實具有良好的降血脂作用，對低密度脂蛋白的調(diào)節(jié)效果尤為明顯，臨床Ⅱ期和Ⅲ期試驗均已明確其良好的安全性和耐受性。近幾年，PCSK9抑制劑開始應(yīng)用于國內(nèi)高血脂、冠心病等疾病的預(yù)防和治療，相關(guān)研究也逐步深入，取得了較大進(jìn)展，相關(guān)藥物也已投入國內(nèi)家族性高膽固醇血癥及無法耐受他汀類藥物患者臨床治療，相關(guān)臨床研究應(yīng)用備受關(guān)注?，F(xiàn)將PCSK9基因與心血管疾病的關(guān)系、PCSK9抑制劑的臨床研究進(jìn)展和PCSK9的不良反應(yīng)等進(jìn)行綜述。

1 PCSK9基因與心血管疾病的關(guān)系

1.1 PCSK9基因遺傳學(xué)研究 PCSK9屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族，主要由前結(jié)構(gòu)域、羧基末端結(jié)構(gòu)域、信號序列和催化結(jié)構(gòu)組成，最初被命名為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶-1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1)，主要在肝臟內(nèi)分泌，亦表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)及小腸等。早期研究主要集中于PCSK9的基礎(chǔ)研究，隨著研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)PCSK9基因與家族性高膽固醇血癥的發(fā)病密切相關(guān)，且部分病例可在早期即發(fā)生了心血管死亡事件[3]。

人類PCSK9基因具有2種突變形式，一種是功能性突變，即突變后的PCSK9降解LDL-R的功能增強(qiáng)，致使血液中LDL-C水平異常升高；另外一種突變?yōu)楣δ苄匀笔?，即突變后PCSK9表達(dá)沉默，機(jī)體內(nèi)對LDLR清除能力增強(qiáng)，血液中LDL-C水平下降，不同個體的突變方向并不相同，且無規(guī)律性可言。臨床研究[4]顯示，PCSK9功能缺失型突變患者對機(jī)體LDL-C水平的調(diào)節(jié)更為有利，對缺血性心臟疾病的預(yù)防效果更佳?；蛲蛔兙哂卸鄳B(tài)性，一項薈萃分析[4]顯示，PCSK9基因E650G位點的多態(tài)性與冠心病風(fēng)險升高有關(guān)，尤其是在中國人群中攜帶PCSK9基因G等位基因的人群更易發(fā)生冠心病。故阻斷PCSK9參與LDL-R降解，穩(wěn)定機(jī)體對LDL-C的清除能力成為目前降膽固醇治療的新方向。

1.2 PCSK9與膽固醇的代謝關(guān)系 研究[5]已明確，高膽固醇血癥與冠脈病變密切相關(guān)，而LDL-C水平是影響機(jī)體膽固醇水平的重要因素，LDL-C與冠脈疾病的風(fēng)險關(guān)聯(lián)性同樣得到了明確。當(dāng)肝臟表達(dá)PCSK9時可調(diào)節(jié)肝臟的膽固醇代謝，繼而誘導(dǎo)動脈緩慢發(fā)生粥樣硬化[6]。正常生理情況下，血液循環(huán)中的LDL顆粒可以被肝細(xì)胞膜表面的LDL-R攝取，并在肝細(xì)胞內(nèi)降解，而LDL-R可重新定植于肝細(xì)胞膜表面。當(dāng)動脈粥樣硬化細(xì)胞局部PCSK9濃度升高時，PCSK9以鈣依賴性方式特異性結(jié)合LDL-R，對細(xì)胞中LDL-R的清除作用增強(qiáng)，這是導(dǎo)致膽固醇水平升高的始動環(huán)節(jié)[7]，且間接影響著動脈病變的程度[8]。但是否存在PCSK9和LDL與LDL-R有競爭性結(jié)合尚未明確。同時，動脈粥樣斑塊形成過程中有促炎因子(M1巨噬細(xì)胞)和抗炎因子(M2巨噬細(xì)胞)的共同參與。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，冠脈局部PCSK9濃度升高時，M1巨噬細(xì)胞被大量釋放并誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖，加速動脈粥樣硬化進(jìn)程，即PCSK9參與了動脈斑塊的炎癥過程，另有研究[10]則明確了PCSK9可通過增強(qiáng)對LDL-R的清除作用或下調(diào)LRP1的表達(dá)水平間接調(diào)節(jié)動脈斑塊的炎癥反應(yīng)過程。

此外，有研究[11-12]指出PCSK9的CRD結(jié)構(gòu)域與抵抗素的結(jié)構(gòu)域具有較高的相似性，后者可通過與TLR4結(jié)合，激活TLR4信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，故推測PSCK9同樣可能通過TLR4調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，即PCSK9對巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)可能并非單一通路作用的結(jié)果。近年動物實驗[13]則表明，PCSK9作為一種炎性遞質(zhì)參與了高膽固醇血癥血管炎性反應(yīng)，且在高脂飲食小鼠模型中敲除ApoEh后，血管炎癥明顯減弱，且TLR-4/NF-κB通路受到明顯抑制。

2 PCSK9抑制劑的研究進(jìn)展

2.1 單克隆抗體 目前關(guān)于PCSK9抑制劑的研究以單克隆抗體為主，許多研究[14]已完成Ⅲ期臨床試驗，多數(shù)試驗結(jié)果均提示PCSK9具有良好的降脂效果，與安慰劑、他汀類藥物相比，PCSK9具有更為廣泛的適用性和良好的降脂效果，在治療高膽固醇血癥、預(yù)防ASCVD方面的效果更為顯著，且可同時改善HDL-C、Lp(a)等其他脂代謝指標(biāo)。PCSK9單克隆抗體，其可與PCSK9競爭性拮抗，阻止PCSK9與LDL-R結(jié)合，繼而增加肝臟內(nèi)LDL-R的表達(dá)，降低LDL-C水平。有研究[15]報道稱，使用PCSK9抑制劑治療高膽固醇血癥后可見巨噬細(xì)胞衍生的促炎因子表達(dá)水平明顯下調(diào)，但高敏C-反應(yīng)蛋白水平無明顯變化。另有研究[16]指出，PCSK9與單克隆抗體合用后可顯著抑制冠脈鈣化程度，有效延緩冠心病的病情進(jìn)展。目前，已有2種單克隆抗體投入臨床使用，臨床醫(yī)生建議對他汀類藥物耐藥、已經(jīng)合并有心血管并發(fā)癥及降脂效果不佳的患者聯(lián)合PCSK9抑制劑治療[17]。

2.1.1 Evolocumab Evolocumab是一種是人源單克隆抗體，由美國安進(jìn)(Amgen)公司研發(fā)，目前已經(jīng)基本完成Ⅲ期臨床研究，有研究[18]指出Evolocumab能夠顯著降低LDL-C水平，為不適宜服用他汀類藥物的高脂血癥患者提供了一種替代治療方案。另外有Ⅲ期研究[19]指出，Evolocumab聯(lián)合他汀類藥物可進(jìn)一步降低LDL-C水平，且采用不同劑量、不同給藥方式單用Evolocumab治療高脂血癥同樣有不錯的效果。2015年ACC年會對Evolocumab藥物治療的長期臨床隨訪結(jié)果進(jìn)行了報道，這項研究[20]共包含OSLER-11和OSLER-2 2項臨床研究，結(jié)果指出聯(lián)合Evolocumab組患者的LDL-C水平從最初的120 mg/dL降低至48 mg/dL，降幅度高達(dá)61%，但與標(biāo)準(zhǔn)治療組相比在不良事件發(fā)生率方面并無明顯優(yōu)勢(64.8%vs69.2%)。目前Evolocumab單抗已經(jīng)成功在我國上市并在臨床中使用。早期大樣本臨床研究系統(tǒng)評價指出，Evolocumab可顯著改善高脂血癥患者的血脂水平[21]，具有較高的臨床應(yīng)用價值，推薦使用方法為皮下注射，推薦劑量為每2周140 mg或420 mg/月[22]。同時，臨床對照試驗指出Evolocumab聯(lián)合他汀類藥物治療后，可在他汀類藥物降脂基礎(chǔ)上進(jìn)一步將LDL-C水平下降71%[23]。此外，無論高脂血癥患者的PCSK9表達(dá)水平如何，Evolocumab均可降低LDL-C水平，且對基因為雜合子型的家族性高脂血癥患者的效果更為理想。另一項研究[24]指出，Evolocumab對不同純合子和雜合子FH患者的降脂效果不同，存在1個或多個LDL-R等位基因缺陷的緩和，服用Evolocumab后LDL-C水平約下降20%，而ApoB突變患者的LDL-C水平可下降約47%，但對陰性等位基因患者基本無治療效果，故對于純合子FH患者，特別是LDLR陰性等位基因患者而言，需要尋求額外的治療。

2.1.2 Alirocumab Alirocumab單抗是由賽諾菲及Regeneron制藥公司研發(fā)的人源性PCSK9單克隆抗體，可用于經(jīng)他汀類藥物治療后，LDL-C水平仍超過70 mg/dL的患者。Ⅲ期臨床試驗[25]結(jié)果指出，存在心血管事件的高風(fēng)險患者，每2周皮下注射150 mg Alirocumake可使患者LDL-C水平下降約62%，明顯優(yōu)于安慰劑組的降脂效果。盡管治療后可能會出現(xiàn)注射部位反應(yīng)、肌肉疼痛、神經(jīng)認(rèn)知事件等不良事件，但與安慰劑組相比，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，故Alirocumab的治療安全性可以接受。目前臨床上推薦的Alirocumab使用方法為皮下注射，推薦劑量為每2周75～150 mg或300 mg/月，通常建議患者從低劑量開始服用，逐步增加服藥劑量，但亦可初始劑量即為高劑量，但需注意給藥間隔的低谷期，加強(qiáng)對LDL-C水平的檢測[26]。有研究[27-28]指出，Alirocumab初始劑量為每2周75 mg時，LDL-C水平可下降45%～48%，而每2周150 mg時，LDL-C水平可下降約60%，臨床上可根據(jù)治療需求以及患者的耐受情況合理選擇初始治療劑量。此外，Alirocumab組患者服藥期間冠心病致死、致命性腦卒中、不穩(wěn)定性心絞痛等心血管不良事件的發(fā)生率明顯低于安慰組，這表明在他汀類最大耐受量基礎(chǔ)上加用Alirocumab可進(jìn)一步下調(diào)LDL-C表達(dá)水平，降低心血管事件風(fēng)險。近年關(guān)于Alirocumab對冠脈及外周動脈斑塊影響的研究已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅳ期階段(NCT03096288)，且研究納入急性心梗PCI術(shù)后的患者，這為研臨床推廣Alirocumab創(chuàng)造了良好的條件。此外，研究[29]報道了急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者聯(lián)合使用他汀類藥物及ezetimibe(依澤替米貝)可臨床獲益。

2.1.3 Bococizumab Bococizumab是輝瑞公司研發(fā)的人源性PCSK9單克隆抗體，相關(guān)研究[30]包括降血脂研究、對心血管事件的遠(yuǎn)期觀察以及安全性評價，而已完成的臨床試驗發(fā)現(xiàn)，Bococizumab的降脂效果會隨著治療時間的延長而逐步衰減，并無法發(fā)揮持續(xù)降低LDL-C的作用，故無法明確其是否能夠令A(yù)SCVD患者持久獲益，這提示盡管PCSK9的臨床應(yīng)用前景十分光明，但仍應(yīng)理性、客觀地看待其治療效果，從長遠(yuǎn)角度分析其臨床風(fēng)險與獲益。

2.2 小分子干擾RNA小分子 干擾RNA(siRNA)主要通過影響PCSK9的mRNA下調(diào)PCSK9的表達(dá)水平，甚至令其表達(dá)沉默。Fitzgerald等[31]發(fā)現(xiàn)，siRNA寡核苷酸ALN-PCS02可顯著降低PCSK9的表達(dá)水平，且其對PCSK9表達(dá)水平的影響呈劑量依賴性，當(dāng)ALN-PCS試驗劑量達(dá)到最大值300 mg時，可令PCSK9表達(dá)水平降低至基礎(chǔ)水平的70%，循環(huán)系統(tǒng)中LDL-C平均水平下降至基礎(chǔ)水平的60%，且服用期間無嚴(yán)重不良反應(yīng)。一種化學(xué)合成siRNA -Inclisiran已進(jìn)入臨床試驗，根據(jù)ORION-1試驗Ⅱ期數(shù)據(jù)[31]，每半年注射Inclisiran 300 mg可使血漿中LDL-C水平下降約50%。目前一項關(guān)于研究Inclisiran治療后心血管重點事件的Ⅲ期臨床實驗(HPS-4/TIMI 65-ORION-4試驗)正在進(jìn)行中。

2.3 反義寡核苷酸 反義寡核苷酸主要通過與PCSK9靶基因特異性結(jié)合抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，間接增加肝臟LDL-R的表達(dá)量，繼而下調(diào)LDL-C水平，這類藥物研究同樣處理臨床前期研究階段[32]，尚且無法驗證其臨床治療效果。但有研究[33]表明，反義寡核苷酸可以通過降低脂蛋白(a)的水平降低家族性膽固醇血癥人群中的心血管事件發(fā)生風(fēng)險。

2.4 基因編輯技術(shù) 目前基因編輯技術(shù)在生物學(xué)各個領(lǐng)域備受關(guān)注。CRISPR-Cas9是來源于細(xì)菌免疫系統(tǒng)、由RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，在生物學(xué)研究上有重要作用。CRISPR-Cas9由Cas9內(nèi)切酶和單導(dǎo)RNA(sgRNA)組成，Cas9-sgRNA介導(dǎo)的DNA切割產(chǎn)生雙鏈斷裂，通過非同源端連接或同源定向修復(fù)觸發(fā)DNA修復(fù)機(jī)制[34]。非同源端連接容易產(chǎn)生錯誤，并在靶位點誘導(dǎo)錯誤插入或缺失，而同源定向修復(fù)可以使用外源DNA修復(fù)模板對基因組DNA的期望改變進(jìn)行精確的編輯[35-36]。有研究[37-39]用CRISPR-Cas9系統(tǒng)將突變引入小鼠的PCSK9基因后，小鼠體內(nèi)低密度膽固醇下降35%～40%及PCSK9水平下降35%～52%。但目前基因編輯技術(shù)的局限性是與期望靶點相似的脫靶位點基因突變以及脫靶位點數(shù)量較多。最新的研究[40]表明，脂質(zhì)納米顆粒能高效傳遞sgRNA,顯著降低小鼠血清PCSK9水平，可進(jìn)一步完善納米顆粒的發(fā)展。但目前此技術(shù)仍處于基礎(chǔ)研究階段，尚無明確臨床治療效果。

2.5 疫苗接種 單克隆抗體可通過被動免疫產(chǎn)生競爭性抗體起到降脂作用，則亦可以通過疫苗接種的主動免疫產(chǎn)生抗體，免疫接種可成為一種有效持久的方法。有研究[41]將靶向PCSK9的破傷風(fēng)病毒與免疫原性肽使用磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺脂質(zhì)在納米脂質(zhì)體表面合并，并吸附到水凝膠上制成疫苗(L-IFPTA+)。將L-IFPTA+疫苗接種在小鼠體內(nèi)，L-IFPTA+疫苗可誘導(dǎo)高膽固醇血癥小鼠對PCSK9產(chǎn)生高滴度IgG抗體，同時研究中(16周)接種疫苗的小鼠體內(nèi)LDL-C有顯著下降，并且促炎因子較少，抗炎因子增多，表明疫苗接種具有長效性以及安全性。目前仍需要更多臨床研究數(shù)據(jù)支持。

3 PCSK9抑制劑不良反應(yīng)

盡管臨床上對PCSK9抑制劑十分關(guān)注，但早期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，服用PCSK9抑制劑可能會引發(fā)過敏反應(yīng)、注射部位反應(yīng)、肌肉酸痛、神經(jīng)功能異常、頭暈等不良反應(yīng)[42]，這引發(fā)了業(yè)內(nèi)對于PCSK9抑制劑安全性的重新思考。目前分析認(rèn)為，PCSK9抑制劑可下調(diào)機(jī)體膽固醇水平，而后者參與了大腦神經(jīng)髓鞘組成，故理論上服用PCSK9抑制劑可通過下調(diào)膽固醇水平間接影響腦神經(jīng)功能，繼而出現(xiàn)精神癥狀[43]；但同時考慮到PCSK9抑制劑為非親脂性大分子物質(zhì)，無法通過血腦屏障，故PCSK9可對腦神經(jīng)的造成直接損害的假設(shè)并不成立。事實上，早在2009年就有關(guān)于他汀類藥物引發(fā)認(rèn)知不良反應(yīng)的相關(guān)報道[44-45]，但后來并未就此展開深入研究。就目前而言，并未發(fā)現(xiàn)PCSK9抑制劑會對神經(jīng)功能和認(rèn)知功能造成顯著損害，且目前缺乏規(guī)范的神經(jīng)認(rèn)知功能評估方法也一定程度上影響了這類研究的觀察和深入探索。國外研究[46]指出，100萬例服用他汀類藥物的患者中有0.3～13.5例患者會出現(xiàn)橫紋肌溶解癥，而目前關(guān)于PCSK9抑制劑的不良反應(yīng)報道中以肌痛較為多見[47]，但尚無可引發(fā)橫紋肌溶解癥的臨床報道，故從治療安全性角度而言，PCSK9抑制劑的不良反應(yīng)相對較輕，安全性相對較好，而對于PCSK9抑制劑引發(fā)不良反應(yīng)的具體機(jī)制仍有待深入研究。

4 指南對比

近期更新的歐洲(歐洲心臟病學(xué)會/歐洲動脈粥樣硬化學(xué)會)[48]和美國(美國心臟協(xié)會/美國心臟病學(xué)會)[49]指南已將PCSK9抑制劑的使用納入臨床指南，并對PSCK9抑制劑的適用條件進(jìn)行了解讀和說明。其中歐洲心臟病學(xué)會指出，當(dāng)LDL-C≥140 mg/dL或LDL-C水平≥100 mg/dL同時伴有快速、進(jìn)行性ASCVD時可使用PCSK9抑制劑，而美國心臟病學(xué)會指南的PCSK9抑制劑適用條件相對寬泛，對于LDL-C≥100 mg/dL、慢性腎臟病、其他降脂方法效果不佳等需要進(jìn)一步降低LDL-C閾值時即可使用，2018年美國心臟協(xié)會/美國心臟病學(xué)會聯(lián)合指南[50]則將PCSK9抑制劑的起始閾值甚下調(diào)至70 mg/dL。目前歐美國家的臨床指南建議降脂治療應(yīng)首選他汀最佳治療量，但考慮到種族、基因的差異，我國臨床工作中并無法完全參考?xì)W美推薦指南，而是主要依據(jù)現(xiàn)行指南，即首選中等強(qiáng)度的他汀類藥物治療，若接受最大劑量他汀藥物聯(lián)合依折麥布治療后血脂仍無法達(dá)標(biāo)或他汀不耐受，必要時可聯(lián)合或單獨使用PCSK9抑制劑，這樣可同時兼顧治療效果和治療安全性,令患者最大獲益[51]。

5 PCSK9抑制劑應(yīng)用展望

PCSK9不僅在肝臟中表達(dá)，對血脂代謝的調(diào)控起到重要作用，而且在腎臟、胰腺以及大腦中均有表達(dá)。目前基礎(chǔ)研究以及臨床研究[52]中發(fā)現(xiàn)，PCSK9對糖代謝、蛋白質(zhì)代謝以及神經(jīng)認(rèn)知功能均有影響，且對心血管其他疾病及腫瘤等多種疾病的形成及進(jìn)展起到重要作用。復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院團(tuán)隊研究[53]發(fā)現(xiàn)，PCSK9可通過與血小板表面受體CD36結(jié)合，從而激活下游信號通路，直接增強(qiáng)血小板活化，加速體內(nèi)血栓形成以及急性心肌梗死后的心梗面積進(jìn)一步擴(kuò)大。PCSK9抑制劑或阿司匹林均可抑制PCSK9與CD36結(jié)合從而減少血栓形成。PCSK9目前也是心房顫動心血管事件的預(yù)測因子，有研究[54]表明PCSK9可通過強(qiáng)化還原型輔酶Ⅱ氧化酶2的活性介導(dǎo)CD36受體通路的血小板激活。由此可以說明PCSK9在體內(nèi)血栓形成機(jī)制中起到重要作用，同時也有研究[55]表明，PCSK9抑制劑可減少腦卒中的發(fā)生率。此外，近期研究[56]發(fā)現(xiàn)，PCSK9的mRNA和蛋白在胃癌組織中較正常組織中有顯著升高，PCSK9通過上調(diào)熱休克蛋白70促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，使得胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)并且抑制癌細(xì)胞凋亡，揭示了PCSK9與胃癌進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。PCSK9抑制劑不僅在降脂以及冠心病方面取得臨床獲益，在其他疾病中也有非常重要的價值和良好的前景。

綜上所述，PCSK9抑制劑是一種新型降膽固醇藥物，且經(jīng)過數(shù)十年的基礎(chǔ)研究和早期臨床試驗，已明確證實PCSK9抑制劑可顯著降低LDL-C水平，預(yù)防心血管不良事件的發(fā)生和發(fā)展，目前PCSK9抑制劑已然成為ASCVD防治的熱門靶點。我國對于PCSK9抑制劑的研究尚且處于初步階段，初期研究證實了PCSK9抑制劑是他汀類藥物不耐受患者的良好替代治療方案。但PCSK9抑制劑預(yù)防ASCVD的效果是否具有持久性，長期服藥安全性如何仍需要長期臨床觀察。PCSK9的肝外作用機(jī)制和信號通路尚不明確，可有待進(jìn)一步完善研究以提高PSCK9抑制劑的使用率。另外，昂貴的價格也是影響PSCK9抑制劑廣泛使用的重要阻礙。