宏基因組學(xué)第二代測序?qū)Ψ尾扛腥镜呐R床指導(dǎo)價值

王霞 胡丹平 趙德軍 顏金農(nóng) 朱慧琳 陳恩國

肺部感染病原體種類繁多，不同病原體引起的肺部感染治療方案不盡相同。隨著廣譜抗生素等使用，人體肺部感染病原體種類發(fā)生變化[1]。傳統(tǒng)病原體檢測方法存在陽性率不高、檢測周期長等缺點[2]，影響疾病的早期診斷，延長疾病治療時間、加重經(jīng)濟負擔(dān)。隨著宏基因組學(xué)第二代測序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）[3]技術(shù)的出現(xiàn)，病原體的檢出率及確診率得到明顯地提高。本次研究探討mNGS 對肺部感染的臨床指導(dǎo)意義?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性選擇2020 年2 月至2021 年5 月期間杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸二科肺部感染43 例患者，其中男性23 例、女性20 例；年齡18～92 歲，平均年齡（51.32±11.26）歲；重癥15 例、非重癥28 例；所有患者肺部CT提示肺部病灶，有咳嗽咳痰、發(fā)熱、胸痛胸悶、咯血、呼吸困難、胸腔積液等呼吸道癥狀與體征；并剔除肺部腫瘤、免疫性、肺血管病變及心臟病相關(guān)肺部病變患者。

1.2 方法 43 例患者均采用mNGS 技術(shù)和傳統(tǒng)病原學(xué)檢測技術(shù)進行病原體檢測。mNGS 檢測選擇迅敏康測序平臺，標本采集（38份肺泡灌洗液和5份靜脈血液樣本），送檢迅敏康公司后進行進行分裝、提取、純化等樣本處理。先通過DNA 片段化、修復(fù)末端、測序接頭連接以及PCR 擴增等步驟制備文庫，然后進行上機測序。再進行人工智能化分析，精準識別病原微生物，由權(quán)威臨床微生物專家和臨床專家結(jié)合長期臨床經(jīng)驗和全球臨床檢驗標準設(shè)定數(shù)據(jù)庫權(quán)重基質(zhì)，結(jié)合權(quán)重選舉式菌種水平標記法自動快速分析解讀。傳統(tǒng)技術(shù)檢測收集與送檢mNGS的標本同時采集一分為二的38 份肺泡灌洗液和5份靜脈血液樣本，送檢本院檢驗科進行涂片及培養(yǎng)等檢測。

1.3 檢測指標 比較mNGS 檢測方法及傳統(tǒng)檢測方法的檢測陽性結(jié)果、病原體種類數(shù)、檢測時間等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢出病原體種類比較 43 例患者通過mNGS檢測出69 種微生物，包括55 種細菌（37 種革蘭陰性菌、18 種革蘭陽性菌），支原體4 種，結(jié)核1 種，衣原體1 種，病毒3 種，真菌5 種。43 例患者通過傳統(tǒng)檢測方法檢測出19 種微生物，包括11 種細菌（7 種革蘭陰性菌、4 種革蘭陽性菌），5 種真菌，1 種結(jié)核，2 種支原體。mNGS 在微生物總的檢出種類數(shù)量明顯高于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.85，P＜0.05）。

2.2 檢測陽性結(jié)果比較 mNGS結(jié)果判讀目前尚無統(tǒng)一的標準，臨床醫(yī)生對mNGS 與傳統(tǒng)檢測技術(shù)結(jié)果進行判讀，通過結(jié)合臨床表現(xiàn)、其他檢驗及影像學(xué)結(jié)果判定，43 例患者通過mNGS 技術(shù)檢測，28 例檢測出病原體并判讀為致病原，且為單一致病原，靈敏度為65.12%，包括非重癥患者18 例，靈敏度為64.29%；重癥患者10 例，靈敏度為66.67%。通過傳統(tǒng)檢測技術(shù)16 例，靈敏度為37.21%，包括非重癥患者9 例，靈敏度32.14%；重癥組7 例，靈敏度46.67%。mNGS 檢測總靈敏度、非重癥患者和重癥患者的靈敏度均明顯高于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2分別=9.65、9.72、6.18，P均＜0.05）。

2.3 非重癥肺炎患者與重癥肺炎病原體檢出的差異 mNGS 技術(shù)檢測出非重癥肺炎患者（28 例）中住院致病菌為細菌15 例（53.57%），結(jié)核分枝桿菌4 例（14.29%），mNGS 技術(shù)檢測出重癥患者主要致病菌為細菌9 例（60.00%），真菌3 例（20.00%），未測檢出結(jié)核分支桿菌。

2.4 檢測時間比較 mNGS 檢測時間平均為（2.31±0.62）d，傳統(tǒng)檢測技術(shù)平均為（3.84±0.93）d，mNGS檢測用時明顯少于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.29，P＜0.05）。

3 討論

mNGS 技術(shù)應(yīng)用于臨床尚需解決許多問題，包括標本中人類基因組的干擾、生物信息學(xué)分析、結(jié)果判斷和解釋等，特別是呼吸道本身為非無菌狀態(tài)，大量定植菌核酸的存在給臨床結(jié)果的判讀帶來了挑戰(zhàn)[4]。mNGS 是新近發(fā)展起來的一種快速、高通量的獲得核酸序列信息的技術(shù)。mNGS 為病原學(xué)診斷掀開新的篇章，通過實踐了解其優(yōu)勢和缺點，并根據(jù)臨床小心求證，充分發(fā)揮該技術(shù)的優(yōu)勢。

自2014 年在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上首次報道1 例用二代測序技術(shù)診斷鉤端螺旋體感染的病例以來，其診斷價值已迅速被認可[5]。2017 年有研究團隊開展了關(guān)于mNGS 應(yīng)用感染性疾病診治的研究，發(fā)現(xiàn)mNGS 靈敏度高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，在結(jié)核、真菌、病毒和厭氧菌診斷方面優(yōu)勢更明顯[6]，抗菌藥物使用對mNGS 的影響小于傳統(tǒng)培養(yǎng)，根據(jù)檢測結(jié)果可以調(diào)整抗菌藥物的治療方案。還有團隊研究表明，mNGS 技術(shù)對于耶氏肺孢子蟲的敏感性高于傳統(tǒng)的顯微鏡檢和吉姆薩染色[7]。本次研究結(jié)果顯示，mNGS 在微生物病原體種類數(shù)、靈敏度明顯高于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，檢測時長明顯少于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），表明mNGS 檢測病原體的靈敏度明顯高于傳統(tǒng)技術(shù)，檢測時間更短，更精準，根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整治療方案可以明顯受益，住院時間更短，節(jié)約治療成本。

本次研究存在較多的不足，樣本量較少，樣本類型局限于肺泡灌洗液及血清，檢測到病原體種類數(shù)較少，下一步研究團隊將擴大樣本量，研究分組更加精細化，進一步研究mNGS 技術(shù)，提高mNGS 對臨床肺部感染診治的應(yīng)用價值。

綜上所述，mNGS 技術(shù)檢測微生物病原體種類數(shù)、靈敏度、精準性、檢測時長均優(yōu)于傳統(tǒng)成熟的檢測技術(shù)，結(jié)合臨床表現(xiàn)調(diào)整治療方案患者可以明顯受益。