劉思妤 劉嫣 歐陽杰

【摘要】目的 探討二氫楊梅素（DHM）對(duì)體外棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老的抑制作用及其與HMGB1/TLR-4通路的關(guān)系。 方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（ HUVECs） ，觀察不同濃度二氫楊梅素干預(yù)PA處理的HUVECs 衰老的變化。檢測(cè)細(xì)胞衰老、測(cè)定細(xì)胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β的含量、檢測(cè)TLR-4 的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 PA處理內(nèi)皮細(xì)胞 48h 能引起細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞增加，細(xì)胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β蛋白含量顯著升高，細(xì)胞中 HMGB1及TLR-4蛋白表達(dá)上調(diào)。與PA組比較，可以增加細(xì)胞活性; 降低細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽性率、TLR-4蛋白的表達(dá)、細(xì)胞中IL-6及IL-1β釋放顯著減少，呈濃度依賴性。 結(jié)論 DHM對(duì)體外PA誘導(dǎo)的HUVECs 衰老有抑制作用，其作用機(jī)制與減少HMGB1釋放、下調(diào)TLR-4蛋白表達(dá)，從而減少炎癥釋放有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】二氫楊梅素;HMGB1;TLR-4;HUVECs;棕櫚酸

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（2018JJ3480）;湖南省教育廳科學(xué)研究?jī)?yōu)秀青年項(xiàng)目（18B498）;湖南省衛(wèi)生健康委科研課題（202102040901）;湖南省普通高校青年骨干教師培養(yǎng)經(jīng)費(fèi)（湘教通[2018]574號(hào)）;湖南省雙一流應(yīng)用特色學(xué)科藥學(xué)學(xué)科項(xiàng)目（湘教通[2018]469號(hào)）資助。

糖尿病是一種以葡萄糖和游離脂肪酸水平升高為特征的代謝性疾病，其嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥已成為威脅人類健康的主要因素。越來越多的證據(jù)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在高脂血癥的環(huán)境中，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮提前衰老，并促進(jìn)血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化，從而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。炎癥的過量產(chǎn)生在細(xì)胞衰老中起著重要作用。高遷移率族蛋白-1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白，在高脂環(huán)境下HMGB1從細(xì)胞核中釋放，通過與晚期糖基化產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，進(jìn)一步觸發(fā)炎癥通路，發(fā)揮促炎作用。二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DHM）是藤茶中的主要黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、調(diào)血脂及降血糖等多種藥理活性。有證據(jù)表明DHM對(duì)心血管有保護(hù)作用，但DHM對(duì)糖尿病血脂異常狀態(tài)下引起的血管病變可能的有益作用尚未完全闡明。在本研究中，我們?cè)噲D證明DHM對(duì)棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老和可能機(jī)制的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs（American Type Culture Collection，ATCC）;DHM、PA（Sigma公司）;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和含EDTA胰蛋白酶（HyClone公司）;HMGB1、IL-6、IL-1βELISA試劑盒（博士德生物工程有限公司）;BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）;TLR4和β-actin一抗（博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs在含有10 %的FBS及1 %青霉素/鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）并于37 ℃，5 % CO2濕潤(rùn)的環(huán)境下培養(yǎng)。待單層細(xì)胞貼壁達(dá) 85% 左右時(shí)，可進(jìn)行傳代或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

用DHM （ 0.1、1、10 μmol/L ） 預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再加PA（0.3 mmol/L）干預(yù)48h。實(shí)驗(yàn)分為：正常對(duì)照組、PA處理組、溶劑組、二氫楊梅素（0.1μmol/L） +PA處理組、二氫楊梅素（1μmol/L） +PA處理組、二氫楊梅素（10μmol/L） +PA處理組。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色方法及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

按廠家說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 β-半乳糖苷酶染色，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察人工計(jì)數(shù)分析統(tǒng)計(jì)藍(lán)綠色的-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞，結(jié)果以陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100%表示。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法測(cè)定IL-6、IL-1β的含量

按廠家說明書，用人HMGB1、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒測(cè)定不同處理后細(xì)胞上清夜中HMGB1、IL-6、IL-1β的水平。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)

所提細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后以β-actin 為內(nèi)參照，兔抗羊TLR4 為一抗，通過Western blotting 法測(cè)定其TLR4 相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間差異顯著性采用單因素方差分析（ One-Way ANOVA） 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間的兩兩比較采用LSD法，P< 0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 DHM對(duì)PA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老SA-β-gal活性的比較

與正常對(duì)照組比較，0. 3 mmol/L PA組SA-β-gal 陽性細(xì)胞率明顯升高（P < 0.01）。與PA組比較，內(nèi)皮細(xì)胞SA-β-gal 陽性細(xì)胞率隨著DHM藥物濃度的逐漸提高顯著降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖1）。

2.2 DHM 對(duì)PA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞 HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白釋放的影響

與正常對(duì)照組比較，PA組細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量明顯增加 （P < 0.01）。與PA組比較，不同濃度DHM 組內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量呈劑量依賴性降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖2）。

2.3 DHM 對(duì)PA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TLR4 蛋白表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組比較，PA組TLR4蛋白表達(dá)明顯增加（P < 0.01）。與PA組比較，不同濃度 DHM組內(nèi)皮細(xì)胞TLR4 蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖3）。

3 討論

本研究首次證明DHM可通過下調(diào)HMGB1及TLR4蛋白表達(dá)抑制炎癥釋放，從而減輕PA誘導(dǎo)的HUVECs衰老。內(nèi)皮細(xì)胞衰老是動(dòng)脈粥樣硬化的起始階段，研究表明，炎癥是誘導(dǎo)衰老的重要因素，而脂毒性刺激可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老。在這項(xiàng)研究中，我們用PA處理HUVECs，模擬糖尿病的血脂代謝病理應(yīng)激狀態(tài)，也證實(shí)了PA能誘導(dǎo)HUVECs衰老。

血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素。PA可通過與TLR4輔助蛋白髓樣分化蛋白2直接相互作用促進(jìn)血管損傷的發(fā)展。HMGB1是一種必要且充分的炎癥介質(zhì)。當(dāng)血管損傷時(shí)，它可以通過TLR4發(fā)出信號(hào)，最終導(dǎo)致NF-κB的激活，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)PA損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中HMGB1釋放、TLR4的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，同時(shí)炎性因子IL-6及及IL-1β 釋放增加。提示PA誘導(dǎo)的HUVECs衰老與HMGB1釋放、TLR4表達(dá)升高釋放炎性因子有相關(guān)性。

以往研究表明，DHM對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷有保護(hù)作用[7]。我們的研究證明，DHM能有效降低PA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率，抑制細(xì)胞衰老。與此同時(shí)，DHM能顯著降低細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6及IL-1β的含量，減少HMGB1釋放及下調(diào)TNF4蛋白的表達(dá)。這提示二氫楊梅素改善PA誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞衰老可能與HMGB1/TLR4信號(hào)途徑有關(guān)。

綜上所述，HMGB1的表達(dá)及釋放增加與PA誘導(dǎo)HUVECs衰老有密切關(guān)系。二氫楊梅素可以通過減少HMGB1的表達(dá)抑制TLR4蛋白表達(dá)，從而抑制炎癥的發(fā)生改善PA誘導(dǎo)的HUVECs的損傷，對(duì)降低糖尿病血脂紊亂引起的血管病變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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第一作者簡(jiǎn)介：劉思妤（1981-），女，湖南郴州，碩士，副教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究。