酸性手性藥物在直鏈淀粉手性固定相上的拆分

祝金艷 徐 文 艾 萍 袁黎明

(云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500)

手性藥物是一類非常重要的化合物，目前臨床藥物有3 500余種，其中約一半為合成藥，而合成藥物中約一半是外消旋體[1]。外消旋體藥物與生物大分子對映體之間具有立體選擇性，導致手性藥物在生物體內(nèi)顯現(xiàn)出不同藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)某些外消旋體藥物中，一種立體異構(gòu)體具有藥效，而另一種則無效或有毒副作用。因此研究手性藥物的拆分方法，對手性藥物的藥理學、毒理學的研究和開發(fā)具有重要意義[2-3]。

高效液相色譜手性固定相法是分離手性化合物對映體最常用的分析方法之一。在眾多的手性固定相中，應用最廣的是由Y. Okmoto課題組開發(fā)的多糖衍生物類手性固定相，該課題組經(jīng)過大量的研究，開發(fā)出了以纖維素和直鏈淀粉為手性分離材料的商品柱。張美[4]等人用4根商品手性色譜柱OD、AD、 IA、Whelk，根據(jù)說明書中推薦的最佳流動相正己烷-異丙醇(90∶10, V/V)、正己烷-乙醇(90∶10，V/V)拆分了扁桃酸、DNB-亮氨酸、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬在內(nèi)的38個手性化合物。邵紅[5]用鍵合纖維素衍生物手性固定相在流動相為正己烷-異丙醇(95∶5，V/V)拆分酮洛芬。

目前大部分的文獻報導是用直鏈淀粉柱在正相模式下拆分手性藥物，與其相比，反相模式的流動相具有低成本、污染小、應用范圍廣等優(yōu)勢，所以反相模式拆分是液相手性固定相法拆分手性化合物的發(fā)展趨勢，具有較好的應用前景。本文將自合成的直鏈淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)分別涂覆到5種表面不同衍生化的硅膠上，在反相流動相(甲醇∶水的3種不同比例)下拆分5種酸性手性藥物，并與正相流動相(正己烷∶異丙醇=9∶1)下的情況做了對比。目前還未見系統(tǒng)研究直鏈淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)分別涂覆到不同衍生化硅膠上的比較研究。本文研究的5個藥物對映體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 扁桃酸(a)、DNB-亮氨酸(b)、布洛芬(c)、酮洛芬(d)、氟比洛芬(e) 化學結(jié)構(gòu)

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)，EYELA磁力攪拌低溫恒溫水槽(PSL-1810，上海愛朗儀器有限責任公司)，RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，DHG-9035A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，AL204梅特勒-托利多電子天秤(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，PHS-25雷磁pH計(上海精密科學儀器有限公司)，Model 1666 Slurry Packer高效液相色譜裝柱機(美國All-tech公司)，XL30ESEM-TMP型掃描電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)，高純水機(英國ELGA Lab Water)，高效液相色譜儀(配有Elite P 1201高壓恒流泵、Elite P 1201紫外檢測器、EC 2006型色譜工作站，大連依利特分析儀器有限公司)。

大孔硅膠(粒徑7 μm，孔徑100 nm，日本Daisoge公司)；直鏈淀粉、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯(阿達瑪斯試劑有限公司)；十八烷基三氯硅烷(95%，阿達瑪斯試劑有限公司)；正辛基二甲基氯硅烷(阿拉丁試劑有限公司)；正丁基二甲基氯硅烷(98%,阿爾法試劑有限公司)；所用溶劑(天津市風船化學試劑科技有限公司)(分析純)；手性化合物(西格瑪和阿拉丁試劑有限公司)。

1.2 手性固定相的合成

直鏈淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(ADMPC)的合成[6-7]：將1 g直鏈淀粉加入到圓底燒瓶中，在100 ℃下真空干燥6 h，冷卻至室溫。N2保護下，加40 mL無水吡啶攪拌1 h，讓直鏈淀粉溶脹，再加入3.9 mL 3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯，在85 ℃ 下攪拌回流24 h，冷卻至室溫，將產(chǎn)物倒入大量的甲醇中，白色絮狀物析出，攪拌過夜，減壓抽濾，用甲醇洗滌，65 ℃下真空干燥24 h，得到白色固體。

C4大孔硅膠的合成：N2保護下，稱取10 g活化大孔硅膠于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL無水甲苯，4 mL正丁基二甲基氯硅烷和10 mL吡啶，110 ℃ 攪拌回流6 h。冷卻后加入1 mL三甲基氯硅烷，110 ℃攪拌回流4 h。反應完成后，冷卻減壓抽濾，依次用甲苯、甲醇、二氯甲烷多次洗滌，然后在50 ℃ 下真空干燥5 h，得到C4反相大孔硅膠。

C8反相大孔硅膠的合成：步驟同C4大孔硅膠。

C18反相大孔硅膠的合成：N2保護下，依次將8 g活化后的硅膠，100 mL無水甲苯，10 mL十八烷基三氯硅烷加入到圓底燒瓶中，110 ℃攪拌回流24 h。冷卻后減壓抽濾，并用無水甲苯多次洗滌。將抽濾后的硅膠迅速加入到圓底燒瓶中，抽真空，充N2，在N2保護下加入100 mL無水甲苯，1 mL三甲基氯硅烷，在110 ℃ 攪拌回流6 h，冷卻后減壓抽濾，依次用甲苯、甲醇、二氯甲烷多次洗滌，在50 ℃下真空干燥5 h，得到C18反相大孔硅膠。

氨丙基大孔硅膠的合成：N2保護下，將10 g活化硅膠加入到150 mL圓底燒瓶， 150 ℃條件下干燥6 h，冷卻至室溫。在N2保護下，先加100 mL無水甲苯攪拌10分鐘，再加1.2 mL無水吡啶攪拌10 min，最后加1.6 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，在100 ℃下攪拌回流24 h，反應結(jié)束后，冷卻減壓抽濾，洗滌多次，真空干燥，得到氨丙基大孔硅膠。

1.3 直鏈淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相的制備

取5個25 mL的燒瓶中，分別加入0.3 g ADMPC和8 mL吡啶將其溶解，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法，將上述溶液分別涂覆于1.7 g的5種硅膠表面，即得到相應的固定相：ADMPC-C4大孔硅膠(CSP-A)、ADMPC-C8大孔硅膠(CSP-B)、ADMPC-C18大孔硅膠(CSP-C)、ADMPC-NH2大孔硅膠(CSP-D)、ADMPC-大孔硅膠(CSP-E)。

1.4 液相色譜柱的制備

將上述制備的 5種手性固定相過250目篩，采用高壓勻漿法裝柱，分別將 1.2 g固定相加入適量的(V正己烷∶V異丙醇=9∶1)溶液做頂替液，在40～50 MPa壓力下裝柱，制備了柱維為2.0×250 mm的液相色譜柱。

1.5 色譜的拆分條件

以V正己烷∶V異丙醇=9∶1、甲醇、V甲醇∶V水=9∶1、V甲醇∶V水=3∶1為流動相，流動相中均添加0.2%的三氟乙酸，并經(jīng)0.45 mm的濾膜過濾，流速為0.1 mL/min，檢測波長為254 nm。扁桃酸、DNB-亮氨酸、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬用流動相進行溶解。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性固定相的核磁表征

在常溫下以氘代吡啶為溶劑，測ADMPC的核磁氫譜。如圖2，化學位移7.20 ppm、7.55 ppm、8.69 ppm是吡啶的氫峰；1.50～2.10 ppm、2.10～2.50 ppm分別是直鏈淀粉結(jié)構(gòu)2-和3-位引入3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯上-CH3的質(zhì)子峰和6-位引入3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯上-CH3的質(zhì)子峰；3.00～6.00 ppm為直鏈淀粉結(jié)構(gòu)上的質(zhì)子峰；6.00～8.00 ppm為苯環(huán)上的質(zhì)子峰；9.00～11.50 ppm為氨基的質(zhì)子峰。由核磁氫譜可以確認直鏈淀粉上2-、3-和6-位的羥基被3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯反應，表明成功合成了ADMPC。

圖2 直鏈淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的核磁氫譜圖

2.2 手性固定相的掃描電鏡表征

高分子溶液具有一定的黏度，將其涂覆到硅膠表面時，需盡量避免硅膠顆粒之間的粘連，商品化的多糖手性柱能做到固定相顆粒的高度分散，該技術是多糖手性柱廠家的核心技術之一。圖3中(A)、(C)、(E)、(G)、(I)是硅膠表面未涂覆ADMPC的掃描電鏡圖，硅膠表面相對光滑。圖(B)、(D)、(F)、(H)、(J)是ADMPC涂覆后的5種不同硅膠，可見硅膠顆粒表面有附著物。另外由于大孔硅膠孔徑大，部分涂覆溶液可能進入到大孔的內(nèi)部。

圖3 10種硅膠的掃描電鏡圖. (A) C4大孔硅膠；(B) CSP-A；(C) C8大孔硅膠；(D) CSP-B；(E) C18大孔硅膠；(F) CSP-C；(G) NH2大孔硅膠；(H) CSP-D；(I) 大孔硅膠；(J) CSP-E

2.3 5種酸性手性化合物在不同流動相下的拆分

表1 手性藥物在5 種色譜柱CSP-A至CSP-E上的拆分數(shù)據(jù)

將ADMPC分別涂覆在4種不同衍生化大孔硅膠及純大孔硅膠上制得CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E， 以V正己烷∶V異丙醇=9∶1為流動相，表1為5種色譜柱對5種酸性手性藥物的拆分性能。實驗結(jié)果表明，扁桃酸、DNB-亮氨酸、酮洛芬、氟比洛芬四種酸性手性藥物在這5根色譜柱均有一定的拆分效果，其中DNB-亮氨酸拆分效果最佳，均能達到基線分離。

將上述的5根色譜柱分別在流動相為甲醇、V甲醇∶V水=9∶1、V甲醇∶V水=3∶1的條件下的拆分5種酸性手性藥物。實驗結(jié)果見表2，結(jié)果表明扁桃酸和酮洛芬在這三種流動相中無拆分，DNB-亮氨酸和氟比洛芬在這三種流動相中均有不同程度的拆分，其中氟比洛芬在流動相為V甲醇∶V水=3∶1的條件下拆分效果優(yōu)于流動相V正己烷∶V異丙醇=9∶1。當流動相為V正己烷∶V異丙醇=9∶1 時，布洛芬在CSP-A～CSP-E上均無拆分效果；當流動相為V甲醇∶V水=3∶1時，布洛芬在CSP-A～CSP-D上得到了一定的拆分。

表2 手性藥物在5種色譜柱CSP-A至CSP-E上的拆分數(shù)據(jù)

2.4 5種酸性手性化合物的最佳拆分條件

對5種酸性手性化合物的拆分條件進行優(yōu)化，得到5種酸性手性化合物的分離最佳譜圖。圖4(a)是扁桃酸在CSP-D，流動相為V正己烷∶V異丙醇=9∶1上的色譜圖；圖4(b)是DNB-亮氨酸在CSP-C，流動相為V正己烷∶V異丙醇=9∶1上的色譜圖；圖4(c)是布洛芬在CSP-B，流動相為V甲醇∶V水=3∶1上的色譜圖；圖4(d)是酮洛芬在CSP-C，流動相為V正己烷∶V異丙醇=9∶1 上的色譜圖；圖4(e)是氟比洛芬在CSP-A，流動相為V甲醇∶V水=3∶1上的色譜圖。圖4的其他色譜條件如下：流速：0.1 mL/min；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：254 nm。

(a)

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，5種酸性手性藥物在5種手性柱上都有不同程度的拆分，不同樣品的最佳拆分條件有一定差異，在反相大孔硅膠上涂覆ADMPC拆分5種酸性手性藥物的整體效果優(yōu)于氨基化大孔硅膠和純大孔硅膠；流動相的選擇對樣品的拆分也有一定的影響，當樣品在大極性流動相下能夠得到拆分時，流動相含水量較高時拆分性能較好；這些不同的手性柱在兩種模式的流動相下拆分酸性手性藥物有一定的互補性。本實驗為后續(xù)相關藥物的對映體分離研究提供了參考。