朱潔茹，歐建平△，李 濤，朱偉杰

（1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510630；2暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510632）

當(dāng)卵泡的竇腔形成后，顆粒細(xì)胞分化成兩種細(xì)胞亞群，分別為圍繞卵泡壁的壁層顆粒細(xì)胞（mural granulosa cells，MGCs）和附著于卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞（cumuluscells，CCs）［1］。MGCs 含有多種激素受體，以自分泌和旁分泌的形式調(diào)控卵泡發(fā)育、成熟與甾體激素合成［2］，常用作研究卵巢功能的細(xì)胞體外模型。目前人MGCs 主要從取卵術(shù)廢棄的卵泡液中獲?。?］，來源易得，但從卵泡液中分離MGCs 需要多次離心等處理，且卵泡液中的MGCs混雜較多紅細(xì)胞和其它雜質(zhì)，干擾因素多。因此，應(yīng)充分闡明MGCs的細(xì)胞體外狀態(tài)，建立合適卵巢功能研究的細(xì)胞模型。

CCs是圍繞著卵母細(xì)胞生長的顆粒細(xì)胞層，與卵母細(xì)胞形成一個(gè)相輔相成的“合胞體”，為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)，調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的恢復(fù)，影響精卵結(jié)合和早期胚胎發(fā)育［4］。在取卵術(shù)中，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物被抽吸出來，隨后按體外受精（in vitro fertilization，IVF）或單精子卵胞漿內(nèi)注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的需要，一部分CCs 被切割而丟棄。這部分CCs 的獲取過程簡單，且沒有過多的其它雜質(zhì)，紅細(xì)胞污染少，從理論上而言，CCs是研究卵巢功能的合適細(xì)胞體外模型。但對CCs 細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，以及與MGCs 細(xì)胞模型的比較仍需充分評價(jià)。

自噬和凋亡是細(xì)胞在應(yīng)對環(huán)境變化時(shí)的兩種方式［5-6］，可以反映細(xì)胞的活性狀態(tài)。本項(xiàng)工作比較人MGCs 與CCs 體外分離及原代培養(yǎng)的效果，并檢測自噬和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來分析分離后的細(xì)胞特性，以期為深入認(rèn)識MGCs 與CCs 的細(xì)胞體外狀態(tài)、建立卵巢功能研究的細(xì)胞模型提供參考資料。

材料和方法

1 顆粒細(xì)胞來源

選取16 例于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI患者取卵日的卵泡液及其卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（223 個(gè)），所收集標(biāo)本均為醫(yī)療廢物，由常規(guī)治療過程產(chǎn)生，標(biāo)本獲取不影響患者的治療。所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)?；颊吣挲g24～43 歲，無合并全身重大臟器疾病或慢性內(nèi)科疾病。

2 主要試劑

0.25 %胰酶、DMEM/F12 培養(yǎng)液和胎牛血清（fe?tal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Paque PREMIUM）購自Pharmacia；臺盼藍(lán)和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購自北京索萊寶公司；卵泡刺激素受體（follicle-stimulat?ing hormone receptor，F(xiàn)SHR）流式抗體購自R&D Sys?tems；紅細(xì)胞裂解液購自BD；高純總RNA 快速提取試劑盒（離心柱型）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑購自TaKaRa；RIPA 裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；脫脂奶粉購自Difco；GAPDH 抗體、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體、P62 抗體、Bax 抗體、Ⅱ抗羊抗兔IgG購自Proteintech。

3 方法

3.1 MGCs和CCs的分離

3.1.1 MGCs 的分離 收集拾卵后棄去的卵泡液，200×g離心10 min 后棄上清，PBS 重懸，并加入等體積的0.25%胰酶，室溫消化15 min 后用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，200×g離心10 min后棄上清，PBS 重懸，然后緩慢地小心地將懸液轉(zhuǎn)移到等量的Ficoll分離液液面上，400×g離心20 min，若此時(shí)液體未出現(xiàn)明顯分層，可適當(dāng)加大離心力或延長離心時(shí)間。至分層明顯后，將中間顆粒細(xì)胞層小心吸出，用含10% FBS 的培養(yǎng)液洗滌1 次后重懸待計(jì)數(shù)。

3.1.2 CCs 的分離 拾卵時(shí)吸出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物后，在MOPS 緩沖液中用1 mL 注射器機(jī)械切割挑出卵子周邊的卵丘顆粒細(xì)胞團(tuán)，并用IVF 液沖洗，隨后轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，加入1～2 mL 0.25%胰酶，室溫下消化并反復(fù)吹打，3～5 min 后用含10%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，PBS 洗滌1 次，離心后重懸待計(jì)數(shù)。

3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活率檢測 稱量4 g 臺盼藍(lán)粉末，加入100 mL純水溶解，過濾后取濾液，即配成4%臺盼藍(lán)母液；使用時(shí)將臺盼藍(lán)母液與PBS 緩沖液以1∶9 的比例配成0.4%工作液。將MGCs 和CCs 細(xì)胞懸液稀釋成（1～10）×105/L 的密度，吸取100 μL 至EP管中，以1∶1 的比例與0.4%臺盼藍(lán)工作液混合，靜置3 min 后吸取10 μL 至血球計(jì)數(shù)板中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率檢測。

3.3 細(xì)胞原代培養(yǎng)、細(xì)胞爬片與HE染色 將MGCs和CCs 細(xì)胞懸液接種至6 孔板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，（24～48）h 換液1 次，第1 次為半量換液，以后為全量換液。培養(yǎng)后48 h 于顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁和生長狀態(tài)并拍照。繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，留作后續(xù)qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

另將部分MGCs 和CCs 分別接種至預(yù)先放有防脫載玻片的24孔板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，（24～48）h 換液1 次，第1 次為半量換液，以后為全量換液。當(dāng)細(xì)胞爬滿載玻片的70%時(shí)取出載玻片進(jìn)行HE染色。

3.4 細(xì)胞純度鑒定 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測FSHR的表達(dá)以進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定。兩種細(xì)胞每106個(gè)細(xì)胞孵育10 μL FSHR 流式抗體，渦旋震蕩，室溫避光孵育30 min，隨后300×g離心5 min，棄上清后加入2 mL PBS 重懸，洗滌1 次。再加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育10 min，洗滌2 次。然后加入200～400 μL PBS，重懸于FACS 流式管中，置于流式細(xì)胞儀上檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5 LC3、P62 和Bax mRNA 的qPCR 檢測 收集對數(shù)生長期的MGCs和CCs，根據(jù)高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）使用說明抽提總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，依次在PCR 反應(yīng)管中加入20 反應(yīng)體系，包括ddH20 7.4 μL，SYBR 10 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，引物1.6 μL，于PCR 儀上反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃10 s，60℃15 s，72℃12 s，總共40個(gè)循環(huán)。所有樣本均按3個(gè)復(fù)孔加樣。引物序列見表1。

3.6 LC3、P62 和Bax 蛋白的Western blot 檢測 每個(gè)樣品根據(jù)細(xì)胞數(shù)量分別加入20～50 μL 含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RI?PA 裂解緩沖液，用BCA 法檢測蛋白濃度。每孔上樣量20 μg，在15%（LC3）或12%（P62、Bax）SDSPAGE 中分離，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinyli?dene fluoride，PVDF）膜上（LC3 采用0.22 μm PVDF膜，P62、Bax采用0.45 μm PVDF膜）。將PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫浸泡1 h，置于含有內(nèi)參抗體、目的抗體的盒子中4℃孵育過夜（抗體稀釋比例如 下：LC3 為1∶500，P62 為1∶1 000，Bax 為1∶1 000，GAPDH 為1∶1 000）。用1×TBST 洗滌后，將膜與Ⅱ抗（稀釋1∶50 000）室溫下放置1 h，1×TBST洗膜3次，超敏發(fā)光液曝光顯色及拍照。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

細(xì)胞分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。qPCR 數(shù)據(jù)用LightCycler 480 軟件進(jìn)行分析，采用相對定量法比較2?ΔΔCt的值；Western blot應(yīng)用ImageJ 1.48圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析。使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)間比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MGCs和CCs的分離耗時(shí)、細(xì)胞總數(shù)及存活率

CCs 的分離耗時(shí)少于MGCs，分離結(jié)束時(shí)的存活率高于MGCs，但細(xì)胞總數(shù)少于MGCs（P＜0.05）。見表2。

表2 MGCs和CCs的分離情況比較Table 2.The comparison of isolation parameters between MGCs and CCs（Mean±SD.n=16）

2 MGCs和CCs的細(xì)胞純度

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測FSHR 的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定，分離后CCs 與MGCs 的FSHR 表達(dá)量分別為（92.23±2.66）%和（81.33±6.57）%，差異具有顯著性（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)分析圖見圖1。

3 MGCs和CCs體外原代培養(yǎng)的生長狀態(tài)

HE 染色可見MGCs 和CCs 生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)呈類成纖維細(xì)胞狀，細(xì)胞偽足延展，相互連接；細(xì)胞核藍(lán)染，圓形，核仁明顯；胞質(zhì)透亮呈淡紅色，可見豐富的黑色顆粒分布，見圖2。培養(yǎng)48 h 后，光鏡下可見細(xì)胞單層貼壁生長，呈梭形或星形，偽足呈絲狀突起，CCs 比MGCs 的細(xì)胞外觀更純凈，細(xì)胞體積更大，伸展?fàn)顟B(tài)更佳，見圖2。

Figure 1.FSHR expression of MGCs and CCs after isolation.圖1 分離后MGCs和CCs的FSHR表達(dá)量

4 LC3、P62、Bax在MGCs與CCs中的mRNA表達(dá)水平

CCs 的LC3 mRNA 表達(dá)水平顯著低于MGCs（P＜0.01），Bax 的mRNA 表達(dá)水平顯著高于MGCs（P＜0.05），CCs 與MGCs 的P62 mRNA 表達(dá)水平比較，沒有顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

5 LC3、P62 和Bax 蛋白在MGCs 與CCs 中的表達(dá)水平

CCs 的LC3-Ⅱ/Ⅰ水平顯著低于MGCs（P＜0.01），Bax 蛋白表達(dá)水平顯著高于MGCs（P＜0.05），CCs 與MGCs 的P62 蛋白表達(dá)水平比較，沒有顯著差異（P＞0.05）。見圖4。

Figure 2.The growth status of MGCs and CCs primary cultured in vitro.HE diagrams of cells climbing 70% of glass slide and light micrograph of cells after primary culture for 48 h were showed（scale bar=200 μm）.圖2 MGCs和CCs體外原代培養(yǎng)的生長狀態(tài)

Figure 3.The relative mRNA expression of LC3，P62 and Bax in MGCs and CCs.Mean±SD.n=16. *P＜0.05，**P＜0.01 vs MGCs.圖3 MGCs和CCs的LC3，P62，Bax mRNA表達(dá)水平

Figure 4.The protein expressions of LC3，P62 and Bax in MGCs and CCs.Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs MGCs group.圖4 MGCs和CCs的LC3、P62和Bax蛋白表達(dá)水平

討 論

顆粒細(xì)胞是卵泡中最大的功能細(xì)胞群，它以自分泌和旁分泌參與卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟［7］，與卵母細(xì)胞生殖生理有著密切聯(lián)系。MGCs 和CCs 是顆粒細(xì)胞的兩個(gè)亞群，借助于MGCs和CCs的研究可以增進(jìn)卵巢功能內(nèi)分泌調(diào)控的認(rèn)識。故此，有必要對MGCs和CCs的細(xì)胞模型進(jìn)行充分評價(jià)。

以往實(shí)驗(yàn)評價(jià)了多種人卵巢MGCs 的分離和提純方法，包括密度梯度離心法、裂解法和沉淀法等，但都不可避免出現(xiàn)分離耗時(shí)長、細(xì)胞純度低等問題［8］，直接影響了細(xì)胞體外狀態(tài)及模型的效果。在本實(shí)驗(yàn)，我們采用機(jī)械切割法+酶解法分離CCs，分離耗時(shí)顯著少于密度梯度離心法分離MGCs。成熟卵子周圍的卵丘細(xì)胞團(tuán)主要成分是CCs 和透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)，故此，分離CCs 只需要把卵丘細(xì)胞團(tuán)從卵丘-卵母復(fù)合物中切割出來，用胰酶或透明質(zhì)酸酶把透明質(zhì)酸消化即可，操作簡單，因而耗時(shí)少。而密度梯度離心法利用淋巴細(xì)胞分離液離心后形成不同的密度梯度，卵泡液中的各種細(xì)胞成分根據(jù)密度不同分布在離心管內(nèi)不同層面，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離純化［9-10］。由于分離MGCs 需收集卵泡液，卵泡液量多，要作多個(gè)離心管分裝進(jìn)行分離，且加在分離液層上的卵泡液一般約3 mL，否則會影響細(xì)胞的沉降速度［11］；加上該分離方法需要多次離心，整個(gè)操作過程較為繁瑣，故分離MGCs耗時(shí)較長。

FSHR 特異性表達(dá)于顆粒細(xì)胞，可用于鑒定顆粒細(xì)胞的純度［12］。在本研究中，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)比較分離后CCs 與MGCs 的FSHR 的表達(dá)，結(jié)果顯示CCs細(xì)胞純度高于MGCs。由于卵泡液成分復(fù)雜，含有大量紅細(xì)胞、少量白細(xì)胞和其他成分［13］，難以通過離心完全棄去雜質(zhì)，導(dǎo)致分離后MGCs仍混有其他細(xì)胞成分，使細(xì)胞純度降低。此外，密度梯度離心法分離MGCs 需要時(shí)間長于CCs 分離法，且MGCs 須經(jīng)歷多次離心洗滌程序，離心力會對細(xì)胞造成損傷［14］，上述因素可能導(dǎo)致MGCs存活率顯著低于機(jī)械切割法+酶解法分離CCs，這是應(yīng)用MGCs 模型須注意的問題；另一方面，相對于從卵泡液可收集到MGCs，CCs 是顯微鏡下對卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物作切割獲得，切割出來的CCs 包裹著大量的黏液團(tuán)，其為細(xì)胞外基質(zhì)成分。為避免黏液團(tuán)的黏性限制CCs 在體外生長［11］，本實(shí)驗(yàn)采用胰酶消化。由圖2 可見，消化了黏液團(tuán)后的CCs比MGCs生長的體積更為飽滿，偽足伸展性更佳，貼壁更好。MGCs在分離時(shí)難分散成單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易成團(tuán)塊狀生長，限制了其延展，且分離的MGCs 不可避免混有紅細(xì)胞，紅細(xì)胞沉降在培養(yǎng)皿底部，影響了細(xì)胞的貼壁。因此，在體外培養(yǎng)，CCs比MGCs顯示出更好的細(xì)胞延展性。

CCs 和MGCs 需經(jīng)歷分離、純化等一系列人為操作才作為細(xì)胞模型用于實(shí)驗(yàn)。為了解體外處理后的細(xì)胞狀態(tài)，除了細(xì)胞存活率，本研究采用了自噬和凋亡基因的表達(dá)變化來進(jìn)一步了解細(xì)胞特性。LC3 是自噬延伸階段的重要泛素化蛋白，其數(shù)量和自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，是分析自噬強(qiáng)弱的指標(biāo)［15］；選擇性接頭蛋白P62可用于評估自噬流的通暢程度［16］；Bax是B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）家族中的促凋亡蛋白，通常認(rèn)為它的激活是導(dǎo)致凋亡發(fā)生的重要事件［17］。結(jié)果表明，CCs 與MGCs 的P62 mRNA 和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，提示兩種細(xì)胞的自噬流通暢程度相似；CCs 中LC3 mRNA 和LC3-II/I 的水平顯著低于MGCs，而Bax mRNA 和蛋白的表達(dá)水平顯著高于MGCs，提示在體外培養(yǎng)下，CCs 可能比MGCs 有較低的自噬活性和較高的凋亡活性，這種情況或許與CCs 脫離了卵母細(xì)胞有關(guān)。在體內(nèi)，CCs圍繞卵母細(xì)胞生長，卵丘-卵母復(fù)合物形成獨(dú)特的微環(huán)境，CCs的生理功能受卵母細(xì)胞分泌因子的調(diào)控，卵母細(xì)胞分泌因子可保護(hù)CCs免于凋亡［18］，而CCs 脫離了卵母細(xì)胞，失去了卵母細(xì)胞分泌因子的調(diào)控，有可能使細(xì)胞的凋亡活性升高。

綜上所述，CCs 比MGCs 分離提純更高效。機(jī)械切割法+酶解法分離CCs 方法簡便，收集細(xì)胞的純度高，細(xì)胞狀態(tài)良好，可用于原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。如需長期體外培養(yǎng)，單獨(dú)的CCs 可能容易發(fā)生凋亡，或需加入卵母細(xì)胞分泌因子等模擬CCs 在體內(nèi)的微環(huán)境，以提高CCs體外培養(yǎng)的穩(wěn)定性。