牦牛KDM7A表達(dá)譜分析及其在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中的表達(dá)

海 卓，熊顯榮，馬鴻程，黃向月，閔星宇，李 鍵

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.青藏高原動(dòng)物遺傳育種資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)作為一種生活在高海拔、強(qiáng)紫外且低氧的高原地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群，是高原地區(qū)人民生活的必需種家畜，其具有“全能家畜”、“高原之舟”的美稱，但與黃牛的繁殖情況不同，通常一年一胎或三年兩胎，因此，其產(chǎn)仔率低下[1]，嚴(yán)重阻礙了牧民的經(jīng)濟(jì)收益。KDM7A(Histone demethylase 7A)是一種染色質(zhì)組蛋白修飾因子，能夠參與哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程。但該基因在牦牛中的表達(dá)模式及作用機(jī)制尚未可知，因此，開展KDM7A與牦牛生殖相關(guān)研究具有重要的科學(xué)意義。

表觀遺傳是一種在不改變堿基遺傳序列情況下進(jìn)行修飾的非孟德爾遺傳，主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾及復(fù)雜三維基因組排列[2-3]。組蛋白修飾是一種在組蛋白特定殘基位點(diǎn)由特定相關(guān)酶作用的重要遺傳修飾。甲基化、乙?；?、磷酸化等是其主要的修飾方式[4]。研究表明，組蛋白去甲基化在遺傳過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[5]，甲基化水平通過(guò)組蛋白甲基化酶(HMTs)和去甲基化酶(HDMs)相互協(xié)調(diào)作用于氨基酸殘基特定位點(diǎn)。根據(jù)是否含有JmjC結(jié)構(gòu)域，可將組蛋白去甲基化酶(HDMs)分為FAD依賴性胺氧化酶KDM1家族與JHDM家族兩大類，其主要作用于組蛋白H3/H4的賴氨酸和精氨酸N-端殘基上。KDM1家族包含2個(gè)成員，KDM1A/LSD1和KDM1B/LSD2，只能作用于組蛋白單甲基化和二甲基化(mel/me2)位點(diǎn)；而JHDM家族利用2-酮戊二酸依賴性加氧酶(2-OGDO)機(jī)制修飾單甲基、二甲基和三甲基化(mel/me2/me3)位點(diǎn)，所以導(dǎo)致細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體較大變異性，同時(shí)說(shuō)明表觀遺傳標(biāo)記具有多功能性[5-7]。

KDM7A又稱為KIAA1718，在N-末端具有PhD結(jié)構(gòu)域，在C-末端具有JmjiC結(jié)構(gòu)域，其活性位點(diǎn)由一個(gè)Fe輔助因子、帶電共底物酮戊二酸(2-OG)3個(gè)保守的氨基酸形成的His-Asp-His三聯(lián)體組成的保守雙鏈β-螺旋(DSBH)[8-9]。已有報(bào)道證實(shí)，KDM7A是一個(gè)組蛋白雙位點(diǎn)去甲基化酶，作用于H3K9和H3K27 二甲基化殘基位點(diǎn)上[10]。KDM7A能夠調(diào)控癌癥細(xì)胞的形成及增殖，Mallm等[11]發(fā)現(xiàn)KDM7A能夠誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤初級(jí)細(xì)胞(Human glioblastoma initiating cells, GICs)分化并促使其形成DNA損傷，Meng 等[12]利用基因編輯技術(shù)，敲除裸鼠KDM7A基因后，Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)和c-Myc癌基因表達(dá)量增強(qiáng)，能夠維持乳腺癌干細(xì)胞(Breast cancer stem cells, BCSCs)的干性。KDM7A能影響生物繁殖過(guò)程，其主要參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物胚胎神經(jīng)元的分化發(fā)育，在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor,FGF4)的直接介導(dǎo)下促使小鼠胚胎干細(xì)胞和早期雞胚的神經(jīng)分化，該基因缺失致使出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育缺陷和胚胎發(fā)育停滯的現(xiàn)象[10,13]。

目前，與KDM7A相關(guān)研究主要涉及該基因?qū)θ祟惏┌Y細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制[11-12]及家禽和小鼠胚胎分化發(fā)育的影響[10-13]，但其在牦牛各組織及卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的作用機(jī)制及表達(dá)模式尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以4周歲的未妊娠成年母牦牛作為試驗(yàn)對(duì)象，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得牦牛KDM7A的CDS區(qū)序列，RT-qPCR檢測(cè)KDM7A在牦牛各個(gè)組織中及卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的表達(dá)水平，旨在分析KDM7A理化性質(zhì)及在牲牛生殖過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，為牦牛育種繁殖提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與組織樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物源于四川成都周邊屠宰場(chǎng)，選擇4周歲未妊娠的母牦牛3頭，屠宰后立即采集心、胃、腎、肝、肺、小腸、脾、肌肉、子宮及卵巢組織。用加入雙抗(青霉素和鏈霉素混合物)的生理鹽水反復(fù)沖洗。用無(wú)菌眼科剪處理為1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的塊狀后立即置于含有RNA保護(hù)劑凍存管中，隨后帶回實(shí)驗(yàn)室置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

TRIzol RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen公司；核酸助沉劑購(gòu)自百泰克公司；PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、2×Phanta? Max Master Mix(Dye Plus)購(gòu)自南京諾唯贊；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)有限公司；DEPC、DNAMarker、感受態(tài)細(xì)胞DH5α皆購(gòu)自天根生化科技有限公司；胚胎專用石蠟油(M-8410)(Sigma)；0.5%透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase,Hyase)：0.5 g透明質(zhì)酸酶粉末(Sigma)和100 mL Medium199；卵母細(xì)胞成熟液(OM培養(yǎng)液)：10%胎牛血清(FBS)、Medium 199培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛公司提供；1 μg/mL促卵泡素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、1 μg/mL促黃體素(Luteinizing hormone, LH)購(gòu)自Vetoquinol公司；1 μg/mL 17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)，0.02 mg/mL丙酮酸鈉(C3H3NaO3)和0.03 mg/mL谷氨酰胺(Glutamine, Gln)購(gòu)自Sigma公司。

1.3 卵巢獲取及卵母細(xì)胞培養(yǎng)收集

牦牛屠宰后立即收集3～5周歲母牦牛(6頭)的卵巢，用含有雙抗的生理鹽水沖洗3～5次，立即置于30 ℃無(wú)菌生理鹽水暫作保存，于3 h內(nèi)帶至實(shí)驗(yàn)室。利用5 mL一次性無(wú)菌注射器抽取表面直徑為2～10 mm大小卵泡的卵泡液。并放置在處于37 ℃恒溫操作板的90 mm培養(yǎng)皿中。在體視顯微鏡下選取卵丘顆粒細(xì)胞致密、細(xì)胞質(zhì)均勻無(wú)皺縮且結(jié)構(gòu)緊密的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes, COCs)，并用提前在培養(yǎng)箱中平衡10 h的OM培養(yǎng)液清洗2次。收集50顆顆粒細(xì)胞緊密包裹的COCs，用37 ℃預(yù)平衡3～6 h的5%透明質(zhì)酸酶處理2 min，致使顆粒細(xì)胞全部從卵母細(xì)胞上脫離，用PBS清洗2～3次得到干凈的GV期卵母細(xì)胞，收集于1.5 mL去酶EP管中備用。以30顆COCs為宜轉(zhuǎn)入平衡10 h的1 mL OM成熟液中。放置于濕度100%、恒溫37.5 ℃、二氧化碳通入量5%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待12 h后在體式顯微鏡下挑取卵丘顆粒細(xì)胞松散的COCs，并用上述方法收集50顆干凈的卵母細(xì)胞置于1.5 mL 去酶EP管中備用，此時(shí)卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅠ期。連續(xù)培養(yǎng)24 h后，用上述方法獲得50顆干凈卵母細(xì)胞收集備用，此時(shí)卵母細(xì)胞處于MⅡ期已排出第一極體。

1.4 牦牛各個(gè)組織及卵母細(xì)胞cDNA獲取及檢測(cè)

在液氮環(huán)境下將各個(gè)組織樣進(jìn)行充分研磨并加入1 mL TRIzol試劑振蕩，將含有不同時(shí)期卵母細(xì)胞的EP管中加入200 μL TRIzol試劑，隨后將以上樣本在80 ℃環(huán)境進(jìn)行過(guò)夜處理。待室溫解凍后分別加入10 μL核酸助沉劑，輕微晃動(dòng)再進(jìn)行靜止，最后依照TRIzol法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)獲得各樣本總RNA，并在核酸濃度測(cè)定儀中進(jìn)行檢測(cè)，選取OD260/280值位于1.8～2.0的RNA樣本，根據(jù)PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟反轉(zhuǎn)錄獲得每個(gè)組織和不同時(shí)期卵母細(xì)胞cDNA。最終收取OD260/280值處于1.8～2.0的cDNA樣本，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 KDM7A基因克隆引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中登錄的預(yù)測(cè)黃牛(Bostaurus)KDM7A序列(GenBank登錄號(hào)：XM_027538848.1)結(jié)合引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。利用NCBI中的Primer-Blast設(shè)計(jì)KDM7A基因定量引物及內(nèi)參定量引物，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.6 牦牛KDM7A基因克隆測(cè)序

以牦牛子宮cDNA作為模板，3對(duì)引物PCR擴(kuò)增體系均為50 μL，其中2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)25.0 μL；上、下游引物(10 μmol/L)各2.0 μL；cDNA 2.0 μL；ddH2O 19.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性(3 min)；95 ℃變性(15 s)，52，57，59 ℃退火(15 s)，72 ℃延伸(45 s)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸(5 min)，置于4 ℃保存。配制2%瓊脂糖凝膠并進(jìn)行電泳檢測(cè)，將目的條帶在紫外光下切割回收，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA回收。在16 ℃溫度下將4 μL DNA片段與pMD19-T載體連接16 h，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并將其接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增菌1.5 h后進(jìn)行離心。涂布于含有氨芐青霉素(Amp)固體選擇培養(yǎng)基中置于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。挑取目的菌落，接種含有Amp液體培養(yǎng)基中搖床過(guò)夜增菌，凝膠電泳篩選陽(yáng)性菌種送由生工生物工程(成都)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 牦牛KDM7A基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 7軟件將KDM7A堿基拼接完整。通過(guò)在線比對(duì)工具Blast檢索各物種KDM7A氨基酸序列，進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)合NCBI在線系統(tǒng)中開放閱讀框ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)分析牦牛KDM7A氨基酸序列。并通過(guò)ExPAsy在線軟件中的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)和PredictPortein(http://www.predictprotein.org)，以及MHMM 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SWISS_MODEL(http://swissmodel.expasy)分析預(yù)測(cè)牦牛KDM7A蛋白質(zhì)重要理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 牦牛組織KDM7A基因表達(dá)譜分析

將各個(gè)組織樣本cDNA作為模板。以β-actin(GenBank登錄號(hào)：XM_027538848.1)作為內(nèi)參基因(表1)分析KDM7A在牦牛各組織中相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系為15 μL，其中ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL；cDNA 1 μL；ddH2O 5.5 μL。定量反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性(3 min)；94 ℃ 變性(15 s)，60 ℃ 退火(30 s)，72 ℃延伸(35 s)，39個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。以上每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.9 牦牛KDM7A基因在不同分裂時(shí)期卵母細(xì)胞中表達(dá)檢測(cè)

利用RT-qPCR技術(shù)，β-actin作為內(nèi)參基因，將1.4中得到的GⅤ期、MⅠ期、MⅡ期卵母細(xì)胞cDNA作為模板檢測(cè)KDM7A在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的表達(dá)量。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參照1.8，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

將以上各樣本獲得的3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果利用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，結(jié)合IBM SPSS Statistic 22統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析法分析各個(gè)組織及不同時(shí)期卵母細(xì)胞中KDM7A表達(dá)量差異顯著性。其中，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛KDM7A基因克隆及序列分析

以子宮cDNA作為模板，利用分段擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增到約1 137，1 121，978 bp的3個(gè)片段(圖1)。分段擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，通過(guò)DNAMAN拼接獲得了2 704 bp的KDM7A基因，其中CDS全長(zhǎng)為2 409 bp，共編碼802個(gè)氨基酸。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，與黃牛、野牛、綿羊和山羊同源性相對(duì)較高，分別為99.75%，99.57%，98.62%，98.46%。但與小鼠同源性相對(duì)較低為89.27%。利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖2)表明，牦牛與黃牛和野牛同源關(guān)系最近,其次是綿羊。由此可見(jiàn)，在物種進(jìn)化中KDM7A相對(duì)保守，即使發(fā)生堿基突變，也多為同義突變。

M.DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記；1-3.KDM7A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 KDM7A基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 牦牛KDM7A蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及功能分析

通過(guò)ExPAsy在線分析工具分析預(yù)測(cè)KDM7A蛋白質(zhì)分子量91.551 ku，等電點(diǎn)為7.81，脂肪指數(shù)為69.93，不穩(wěn)定指數(shù)為60.10，說(shuō)明該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白，且預(yù)估半衰期為30 h。KDM7A蛋白含量較高的氨基酸有絲氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)，含量分別為11.0%，8.2%和8.0%；含量較低的氨基酸有半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)，含量分別為2.0%，1.9%和1.5%;不含吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)；正電殘基精氨酸和賴氨酸(Arg+Lys)110個(gè)；帶負(fù)電殘基天冬氨酸和谷氨酸(Asp+Glu)108個(gè)。蛋白質(zhì)親疏水性分析，異亮氨酸(ILe)親水性4.500，賴氨酸(Lys)親水性為3.900，且該蛋白質(zhì)中大多數(shù)氨基酸殘基親水性數(shù)值小于零，總親疏水性平均值為0.715，因此KDM7A為親水性蛋白。MHMM 2.0 Server和SignalP-4.1預(yù)測(cè)分析KDM7A沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分泌蛋白。分析發(fā)現(xiàn)，KDM7A有98個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)N-端糖基化位點(diǎn)。結(jié)合SMART在線分析KDM7A含有JmjiC結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析α螺旋占25.44%，延伸鏈占20.32%，該蛋白質(zhì)不含β-轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)則卷曲占54.24%(圖3)。同時(shí)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，KDM7A蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)含有α螺旋，無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，且結(jié)果顯示延伸鏈主要位于α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)之間(圖4)。

紫色.無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)；藍(lán)色.α螺旋(Hh)；紅色.延伸鏈(Ee)。

圖4 牦牛KDM7A三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 牦牛組織KDM7A基因表達(dá)譜

利用RT-qPCR技術(shù)，結(jié)合2-ΔΔCt法計(jì)算出KDM7A在各組織中的Ct值，并利用SPSS 22分析各組織中相對(duì)表達(dá)量差異性。以子宮Ct值作為參照，結(jié)果表明，KDM7AmRNA在子宮中表達(dá)量最高，在胃中表達(dá)量次之，子宮中KDM7A相對(duì)表達(dá)量顯著高于除胃組織以外其他組織(P<0.05)，腎臟和肌肉組織中KDM7A相對(duì)表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)(圖5)。

相同字母代表差異不顯著(P>0.05)；不同字母代表差異性顯著(P<0.05)；內(nèi)參基因.β-actin。圖6同。

2.4 牦牛KDM7A基因在不同分裂時(shí)期卵母細(xì)胞中表達(dá)

以MⅡ期卵母細(xì)胞中KDM7AmRNA相對(duì)表達(dá)量作為參照，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)卵母細(xì)胞在成熟過(guò)程中表達(dá)規(guī)律(圖6)。結(jié)果顯示，MⅡ期卵母細(xì)胞KDM7AmRNA表達(dá)水平顯著高于M Ⅰ期和GⅤ期(P<0.05)，但MⅠ期與GⅤ期卵母細(xì)胞中KDM7AmRNA相對(duì)表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。

圖6 牦牛不同分裂時(shí)期卵母細(xì)胞中KDM7A基因表達(dá)水平

3 討論與結(jié)論

染色質(zhì)、染色體是真核生物處于有絲分裂及減數(shù)分裂特定時(shí)期的特殊形式，其基本單位是由組蛋白H2A、H2B、H3和H4構(gòu)成八聚體與DNA緊密纏繞形成的核小體[14]。目前大量研究報(bào)道表明，表觀遺傳修飾中DNA甲基化修飾在轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15-17]，隨著組蛋白修飾研究的開展，已證實(shí)組蛋白修飾與DNA甲基化在表觀遺傳中皆發(fā)揮舉足輕重的作用[18]。最初對(duì)組蛋白去甲基化修飾的研究主要集中于植物昆蟲[19-21]、基因互作[22]、化學(xué)干擾表達(dá)[23]、癌癥調(diào)控[5]等方面，最新研究證實(shí)KDM7A影響動(dòng)物早期胚胎神經(jīng)分化及胚胎發(fā)育[13]。Kim等[24]發(fā)現(xiàn)賴氨酸脫甲基酶LSD1調(diào)節(jié)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中LSD1條件性缺失導(dǎo)致紡錘體和染色體異常，致使卵母細(xì)胞無(wú)法從GⅤ期發(fā)育至MⅠ期，隨后發(fā)生細(xì)胞凋亡。Kawakami等[25]通過(guò)敲除小鼠早期胚胎KDM2A，結(jié)合免疫組化、免疫熒光等技術(shù)發(fā)現(xiàn)KDM2A缺失導(dǎo)致10.5～12.5 d胎鼠致死并伴有嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷，細(xì)胞增殖減少并增加細(xì)胞凋亡；且KDM7A缺失在分子調(diào)控層面導(dǎo)致Polycomb組蛋白(PcG)介導(dǎo)的組蛋白H2A泛素化下調(diào)及細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p21Cip1上調(diào)。但KDM7A在牦牛生殖過(guò)程中的研究仍較少。早期報(bào)道探究KDM7A在癌癥細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控狀況[5]，近2 a出現(xiàn)少量研究報(bào)道關(guān)于KDM7A在哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程中的影響，但對(duì)牦牛生殖過(guò)程的影響仍未可知[10，26]。因此，探討KDM7A在牦牛及其生殖過(guò)程中的表達(dá)模式及分子機(jī)制尤為重要，具有廣泛深層研究?jī)r(jià)值。

本試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)首次成功克隆獲得牦牛KDM7A基因CDS區(qū)序列。通過(guò)進(jìn)行同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，KDM7A在不同物種之間同源性較高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)牦牛、黃牛和野牛該核苷酸序列高度吻合，且KDM7A與KDM2/7亞家族中的KDM2A都具有JmjC和PHD結(jié)構(gòu)域[27]，且該結(jié)構(gòu)域從酵母到哺乳動(dòng)物細(xì)胞高度保守。綜上表明，KDM7A基因不易突變具有高度保守性，該基因編碼蛋白的功能也高度保守，這在物種進(jìn)化過(guò)程中使處于自然界的動(dòng)物之間具有生存協(xié)調(diào)穩(wěn)定性。

KDM7A在動(dòng)物不同組織中發(fā)揮作用不盡相同[5,28-29]。本研究選用β-actin作為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)牦牛各組織中KDM7AmRNA的相對(duì)表達(dá)量水平。結(jié)果表明，KDM7A在牦牛各組織中廣譜表達(dá)，且在子宮和胃中表達(dá)量較高，在肌肉和腎中表達(dá)量較低。該結(jié)果與已有研究存在相同點(diǎn)，有報(bào)道已證實(shí)KDM2A在牦牛子宮組織中相對(duì)表達(dá)量最高[27]，推測(cè)KDM2/7亞家族中各個(gè)去甲基化酶在發(fā)育繁殖過(guò)程中具有協(xié)同作用的可能。已知KDM7A作為維持胚胎神經(jīng)分化過(guò)程中重要調(diào)節(jié)因子，該基因在早期胚胎神經(jīng)分化的早期階段表達(dá)增加且具有時(shí)序性[13]。子宮是胚胎著床及胎兒發(fā)育重要場(chǎng)所，因此,推斷母體子宮KDM7AmRNA相對(duì)表達(dá)量較高或與胚胎神經(jīng)分化及胎兒發(fā)育有關(guān)，但該基因在子宮中具體分子調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)行深一步研究。

為了進(jìn)一步探究KDM7AmRNA在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的表達(dá)規(guī)律。本研究利用RT-qPCR檢測(cè)出KDM7AmRNA在牦牛不同時(shí)期卵母細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。KDM2AmRNA在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程與KDM7A mRNA在牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中表達(dá)趨勢(shì)相同[27,30]。進(jìn)一步推測(cè)KDM2/7亞家族中各成員在繁殖發(fā)育過(guò)程中或存在關(guān)聯(lián)，但與王帥[30]研究KDM7AmRNA在牛不同卵母細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量差異性卻不一致，可能是由于物種特異性及牦牛特殊生存環(huán)境所致，具體原因有待進(jìn)行深入研究。Marinho等[29]結(jié)合細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)豬卵母細(xì)胞中H3K27的一、二、三甲基化程度，證實(shí)JHDMs動(dòng)態(tài)作用于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中，促使卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂，其中H3K27me1和H3K27me2甲基化熒光信號(hào)呈下降趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，KDM7AmRNA在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中呈上升趨勢(shì)，且已知KDM7A作用于H3K27me2位點(diǎn)，因此，本研究KDM7AmRNA表達(dá)趨勢(shì)與H3K27me2位點(diǎn)甲基化熒光信號(hào)減弱結(jié)果相一致。但KDM7A在卵母細(xì)胞中具體調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

本研究首次成功克隆獲得牦牛KDM7A基因序列，生物進(jìn)化樹等分析發(fā)現(xiàn)KDM7A在物種之間具有高保守性，且其在子宮中的表達(dá)量較高，在肌肉和腎中表達(dá)量較低；此外，KDM7A參與整個(gè)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程，在不同時(shí)期卵母細(xì)胞表達(dá)量具有顯著差異，但其在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。以上研究結(jié)果為牦牛繁殖研究提供可靠的基礎(chǔ)理論依據(jù)。