李 菁,張小飛

(1.西安文理學院 生物與環(huán)境工程學院,陜西 西安 710065;2.西安市農業(yè)技術推廣中心,陜西 西安 710061)

玉米(ZeamaysL.)是糧食、飼料和工業(yè)原料兼用型作物,在農業(yè)生產和經濟發(fā)展中占有重要地位。由于栽培品種遺傳基礎狹窄,加上多年的連作、氣候變化等多重影響,每年由于病害造成的產量損失達總產的10%以上。玉米灰斑病是由尾孢菌(Cercospora)侵染引起的一種世界性玉米病害,1924年在美國伊利諾伊州首次被發(fā)現[1]。我國在遼寧、吉林、黑龍江等北方春玉米區(qū)、黃淮海夏玉米區(qū)普遍發(fā)生,在云南、四川、湖北等地發(fā)生呈現快速上升趨勢,已經成為我國玉米生產上重要葉部病害,對玉米生產造成了很大威脅。玉蜀黍尾孢菌(Cercosporazeae-maydis)和玉米尾孢菌(C.zeina)為引起玉米灰斑病的2種主要病原。在遼寧、吉林、黑龍江、河北發(fā)生的灰斑病病原為玉蜀黍尾孢菌,在貴州、四川、陜西、河南發(fā)生的灰斑病病原為玉米尾孢菌[2]。由于玉米尾孢菌灰斑病是新發(fā)生病害,對抗病遺傳的了解尚未深入,致使玉米尾孢菌灰斑病抗病基因定位進展較緩。對灰斑病的前期研究多集中在由玉蜀黍尾孢菌侵染的灰斑病,而對由玉米尾孢菌侵染的灰斑病抗性基因定位缺乏深入研究。

目前，基因定位主要是基于遺傳圖譜定位與集群分離分析法(Bulked segregant analysis, BSA)[3]。傳統遺傳圖譜定位周期長、密度低、成本高;而BSA分析是將分離群體中表現出極端性狀的個體混合起來構建2個混池,快速定位與目的基因緊密連鎖分子標記的分析方法。SLAF-seq(Specific locus amplified fragments sequencing)又稱為特異性位點擴增片段測序技術,是大規(guī)模基因分型的一項非常有效的方法,該技術具有諸多優(yōu)點,包括標記開發(fā)成本低、效率高和大群體的高容納力等,已廣泛運用于功能基因定位、遺傳圖譜構建和遺傳多態(tài)性研究[4-6]。

本研究選用玉米尾孢菌灰斑病抗病自交系R225與感病自交系掖478作為親本,通過雜交、自交等方法構建F2分離群體共345個單株,在2013-2014年連續(xù)2 a采用田間自然誘發(fā)在云南德宏、湖北恩施進行抗灰斑病表型鑒定,利用集群分離分析法(BSA)對F2遺傳分離群體(2個親本和30株抗病材料+30株感病材料的極端性狀混池)進行玉米尾孢菌灰斑病抗性關聯分析,為今后開展玉米尾孢菌灰斑病抗性QTL的精細定位和分子標記輔助育種提供了材料基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及構建方法

根據多年多點的田間自然誘發(fā)輔以人工接種鑒定結果并參考農藝性狀表現,選取玉米自交系R225和掖478為供試材料。R225是四川省農科院植保所玉米研究室連續(xù)多年篩選的高抗灰斑病的優(yōu)良自交系,因絕大部分表現高抗或抗病的自交系屬于熱帶或亞熱帶種質背景,而R225是為數不多的溫帶種質中的高抗自交系,表現高抗,高配合力,對發(fā)掘溫帶材料抗性基因具有重要意義。掖478為高配合力的感病自交系,是我國玉米育種研究工作中普遍采用的優(yōu)勢自交系,對玉米性狀改良具有很高的育種應用價值。2011年冬季在海南三亞以R225為父本,掖478為母本進行雜交,獲得F1(經抗性鑒定,植株均表現抗病),2012年夏季將F1植株套袋自交產生F2群體共345個單株,將親本、F2分離群體于2012年冬播種于海南試驗基地,并套袋自交產生F2:3家系種子?？剐澡b定于2013,2014年連續(xù)2 a在云南德宏、湖北恩施田間自然誘發(fā)表型鑒定,在玉米進入乳熟期開始調查。調查時目測每份鑒定材料群體的發(fā)病狀況,記載病情級別。

1.2 葉片DNA提取、樣品處理

當玉米生長至5-6葉期時,每株取少量新鮮葉片,采用CTAB法提取F2單株的基因組DNA,用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定A260及A280,計算樣品濃度,并以1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。經純度和濃度檢驗合格后,選取30株抗病單株DNA樣品進行等量混合,組成F2抗池(R混池),將30株感病單株DNA樣品進行等量混合,組成F2感病池(S混池),將親本與抗、感病池DNA用于后續(xù)SLAF-seq測序。

1.3 酶切方案的設計及SLAF標簽分析

將玉米基因組作為參考基因組進行酶切位點預測并制定后續(xù)酶切方案,經檢測提取的基因組DNA濃度及純度合格后,對各基因組DNA樣品進行酶切。將所得酶切片段(即SLAF標簽)按照順序分別進行3′端加A尾處理、Dual-index4測序接頭連接處理、PCR擴增、產物純化、樣品混合、電泳選取目的片段進行切膠,待構建的SLAF-seq文庫質量檢測合格后,應用Illumina HiSeqTM 2500測序儀進行高通量測序。為評價酶切試驗的有效性,同時選擇水稻(Oryzasativa)作為對照樣品(Control)進行同步測序,測序工作由北京百邁客生物技術有限公司完成。

1.4 信息分析流程

數據分析步驟參照王偉等[7]方法,利用Dual-index對所獲得的原始測序數據進行識別,得到各個樣品的讀數(reads)。測序讀數經過濾接頭后對測序質量和數據量進行進一步的考察和評估。通過對照試驗的數據來進行RsaⅠ+HaeⅢ酶切效率的評估,據此來判斷試驗過程是否符合準確性和有效性的標準。通過比對讀數(reads)與參考基因組,在親本和混池中開發(fā)SLAF標簽,在親本中搜尋具有多態(tài)性的SLAF標簽和位于reads覆蓋區(qū)域中的SNP位點。進一步將所得SNP位點進行關聯分析,得到與抗性性狀緊密相關的位點,并根據關聯閾值確定候選區(qū)域,然后進一步對候選區(qū)域內的基因在GO、SwissProt、NR、COG及KEGG 5個數據庫中進行功能注釋。

2 結果與分析

2.1 酶切與建庫

使用玉米基因組為參考來預測酶切位點,根據酶切原則選擇了RsaⅠ、HaeⅢ 2種限制性內切酶。酶切片段在414～444 bp為SLAF標簽。對SLAF標簽在每條染色體上的數目進行統計,由表1可見,Chr1標簽數最多為23 398個,Chr10標簽數最少為11 678,與染色體長度正相關,染色體越長,標簽數越多。10個染色體共計162 429個SLAF標簽,可見SLAF標簽在基因組各染色體上基本呈現均勻分布(圖1)。說明酶切方案可行。

表1 各染色體中的SLAF標簽數量

圖1 SLAF標簽在參考基因組上的分布

2.2 測序數據統計和檢驗

通過去除接頭100 bp×2讀取長度作為后續(xù)使用的數據進行評價和檢驗,以保證數據質量。對各樣品的測序reads數量、Q30(即測序質量值≥30)和GC含量,共獲得42.05 M reads數據,測序平均Q30為83.77%,平均GC含量為47.07%(表2)。水稻Control測序獲得0.55 M reads的數據量。用SOAP軟件將對照的測序reads與參考基因組進行比對,雙端比對效率在80.90%,比對效率正常。

表2 各樣品測序數據統計

2.3 SNP標記的獲得及關聯分析

利用玉米參考基因組共開發(fā)189 966個SLAF標簽,供試樣本中共開發(fā)獲得696 139個SLAF標簽,其中感病親本(S)得到166 880個SLAF標簽,抗病親本(R)得到152 193個SLAF標簽,S混池得到188 154個標簽,R混池得到188 912個標簽;供試親本(S和R)的測序深度平均為40.30×,混池(S混池和R混池)測序深度平均為44.52×(表3)。根據測序結果讀數在參考玉米基因組中的定位結果,通過GATK局部多重比對及Samtools變異檢測2種方法得到變異位點的交集,獲取SNP最終位點集,SNP信息見表4。根據玉米每條染色體中SLAF的分布情況,進一步繪制SLAF標簽和SNP標簽染色體分布圖(圖2)。

表3 SLAF標簽統計

表4 SNP信息統計

圖2 SLAF標簽和SNP標記在染色體上的分布

采用SNP_index方法進行關聯分析[8],首先過濾559 927個SNP位點,接著需過濾掉存在多重突變的408個SNP位點,然后再需過濾掉讀數支持度<4的共計403 737個SNP位點,最后再過濾掉親本中不存在的106 294個SNP位點,最終獲取49 488個有效SNP位點。依據計算機軟件系統模擬試驗計算結果,當置信度為0.99時,定位起始區(qū)域位于第2號染色體14 002 645處,終止位置22 027 721處,關聯區(qū)域大小為8.03 Mb,包含基因數量504個。使用Blast軟件將關聯區(qū)域內的504個基因分別在SwissProt、NR、KEGG、COG及GO 5個數據庫中進行比對,最終獲取376個基因的信息,并對關聯區(qū)域內基因注釋結果進行統計(表5)。結合已公布的玉米品種 B73 基因組序列,將目標基因定位區(qū)域基因組序列與 B73 全基因組序列進行比對,對目標基因初步定位所在區(qū)域的候選基因進行功能預測,分析親本中外顯子區(qū)域內具有差異的SNP位點,并進行變異注釋(表6),在其中發(fā)現共有12個SNP位點存在非同義編碼突變現象,可分別對應到6個基因上。進一步對候選區(qū)域內非同義突變對應的6個候選基因在GO、SwissProt、NR、COG及KEGG 5個數據庫進行注釋,基因注釋信息見表7。由于NR、COG和KEGG 3個數據庫中功能基因的有效注釋信息過少,因此,表7僅列出GO和SwissProt 2個數據庫的基因注釋結果。對這6個候選基因的注釋結果發(fā)現,這些基因的功能與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、ATP及GTP結合、細胞信號轉導及作為一些重要蛋白質的前體或結構域組成等方面相關。推測這些蛋白在監(jiān)測病原菌入侵和隨后的防御響應方面具有重要作用,作為與抗病性狀直接相關的候選功能基因。今后還需進一步對這6個候選基因進行功能驗證分析。

表5 關聯區(qū)域及候選區(qū)域內非同義突變的基因功能注釋結果統計

表6 SNP注釋結果統計

表7 候選基因在GO和SwissProt數據庫中的注釋結果

2.4 關聯區(qū)域內基因的GO富集分析

GO數據庫作為一種標準生物學的結構化注釋系統,該數據庫建立了基因及其編碼產物功能的相對分類體系,在生物物種中具有普適性。GO數據庫的結構分成了多個層級,如層級越低則節(jié)點所代表的功能注釋越詳細。GO分析可按照細胞組成、分子功能和生物過程三大模塊對所有注釋的基因進行分類[9]。本研究關聯區(qū)域內的基因在GO數據庫中的分類統計結果如圖3所示。以細胞組成模塊中分析為例,在關聯區(qū)域內基因的TopGO富集結果可以看出,所有基因注釋到該部分的功能包括:胞外區(qū)、膜、細胞連接、大分子復合體、細胞器等;而在分子功能模塊中,注釋到該部分的基因功能包括核酸結合轉錄因子活性、催化活性、受體活性、鳥苷酸交換因子活性、運輸活性、結合活性、電子載體活性、抗氧化劑活性、酶調節(jié)活性及分子傳感器活性等。富集節(jié)點的顯著性統計可以看出,其中GO:0033290、GO:0016282、GO:0005852富集顯著性最高(表8)。

1.胞外區(qū);2.膜;3.細胞連接;4.大分子復合體;5.細胞器;6.細胞器部分;7.膜部分;8.細胞部分;9.核酸結合轉錄因子活性;10.催化活性;11.受體活性;12.鳥苷酸交換因子活性;13.結構分子活性;14.運輸活性;15.結合活性;16.電子載體活性;17.抗氧化劑活性;18.金屬伴侶活性;19.酶調節(jié)活性;20.分子傳感器活性;21.生殖;22.免疫系統代謝過程;23.新陳代謝過程;24.細胞過程;25.繁殖過程;26.多細胞生物過程;27.發(fā)育過程;28.生長過程;29.單細胞生物過程;30.生物階段;31.應激反應;32.生物定位;33.多系統過程;34.生物調節(jié);35.細胞成分組織或生物起源。

表8 關聯區(qū)域內基因的TopGO富集結果(細胞組分)

3 討論

本研究通過構建抗感病極端混池,利用SLAF-BSA技術對玉米尾孢菌抗灰斑病進行研究,將抗病相關基因關聯區(qū)域定位于2號染色體 14 002 645～22 027 721區(qū)域內,獲得6個與抗病相關的候選基因。宋軍鋒等[10]用BC2F4群體將抗病QTL定位在2號染色體,與本研究結果相符合,說明在2號染色體真實存在抗性QTL。此外,Bubeck等[11]通過RFLP分子標記技術對3個F2∶3群體進行了研究,結果在10條玉米染色體上均發(fā)現存在抗病QTL。Lehmensiek等[12]通過BSA法發(fā)現了11個與玉米灰斑病抗性相關的多態(tài)性AFLP標記,并將這些標記進一步轉化為特異性PCR序列標記位點,發(fā)現其中5個標記分別與3個抗玉米灰斑病QTL存在連鎖,分別定位在1，3，5號染色體上。Zhang等[13]利用高抗自交系Y32和高感自交系Q11組建的161個F2∶3家系群體進行玉米抗灰斑病QTL的初定位,掃描得到2個主效的QTL,qRgls1和qRgls2,分別位于bin5.04和bin8.02上。目前,針對玉米灰斑病抗性遺傳研究主要以玉蜀黍尾孢菌侵染的灰斑病為主,對玉米尾孢菌僅限于病原學、發(fā)生規(guī)律的研究[2,14],已有研究結果并不能完全反映玉米尾孢菌灰斑病的抗病遺傳規(guī)律。試驗表明,引起灰斑病的2種病原菌的致病力有差異,玉米尾孢菌引起的玉米灰斑病,發(fā)病初期通常在葉片上形成退綠色的微型斑塊,之后隨著病情發(fā)展,病斑逐漸擴大形成淡灰色至淺褐色長條形斑,后期病斑聯結成片狀,病斑受葉脈限制,沒有明顯的邊緣;而由玉蜀黍尾孢菌引起的玉米灰斑病在葉片邊緣可見明顯的褐色線形斑紋,形成的病斑在不同玉米品種上的大小及形狀也可能存在差異,如遇到適宜的氣候條件時,則病斑會加速蔓延擴展甚至引起整片葉子枯死。因此,應有針對性的加強抗玉米尾孢菌灰斑病抗性遺傳機制研究,以有效控制該病害的流行與嚴重為害。

SLAF-seq技術作為一項高度自動化測序技術,以生物信息學、高通量測序等技術為基礎,可獲得全基因組分布的極大量的序列信息,高密度的序列信息可實現對候選功能區(qū)域的精細定位,高覆蓋度和數字化信號為標簽的準確性提供了保證,進而保證了基因定位準確性[15-16],已經運用在玉米、小麥、水稻等糧食作物上,并取得了顯著的效果[17-19]。目前,SLAF和BSA技術已在高效開發(fā)利用植物基因組方面展開了應用,陳士強等[20]基于SLAF-seq技術,開發(fā)了20個長穗偃麥草1E染色體特異分子標記、2個長穗偃麥草基因組特異分子標記及26個其他特異性分子標記,基于優(yōu)良性狀與分子標記共分離的性質,最終獲得抗性基因連鎖相關的一系列分子標記。利用BSA已成功精細定位水稻真菌稻瘟病[21]、擬南芥抗寄生疫霉病基因位點[22]、小麥高籽粒蛋白含量基因GPC-B1[23]。SLAF-seq技術因其低成本、高特異性、高準確率、穩(wěn)定可重復性好等優(yōu)點,可大大縮短得到遍布于整個基因組海量序列信息的時間,有效地應用于標記開發(fā),是實現候選功能區(qū)精細定位的一種有效的技術手段。

研究灰斑病抗病候選基因,發(fā)掘與抗病基因相連鎖的分子標記,有助于研究植物的抗病機理,并為利用分子標記輔助改良抗性性狀提供了理論支撐[14,24-25]。今后的工作重點是通過構建精細定位群體進一步對主效QTL進行定位和克隆,并在現有基礎上搜尋與玉米灰斑病抗性基因緊密關聯的分子標記,進而應用該標記對其衍生株系進行性狀改良,或是將R225株系中的抗性基因導入至其他自交系,通過有利性狀基因的聚合,從而研發(fā)更多抗灰斑病的優(yōu)良玉米育種新材料。本研究結果為今后開展玉米尾孢灰斑病抗性QTL的精細定位和分子標記輔助育種奠定了一定的理論基礎,對防控灰斑病的發(fā)生、減少該病對玉米生產的影響起到積極作用。