鄭 亮,謝 熙,鄭宏坤,徐東杰,朱冬發(fā)

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 寧波 315823)

保幼激素(Juvenile hormone,JH)是無脊椎動物生長發(fā)育過程中的一種重要激素,參與調(diào)控生長、性腺發(fā)育、變態(tài)等重要的生理過程[1]。血淋巴JH濃度變化受到其合成通路及降解途徑的調(diào)控[2]。保幼激素環(huán)氧化水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)和保幼激素酯酶(JH esterases,JHE)是JH降解過程中的重要酶,它們分別水解JH的環(huán)氧結(jié)構(gòu)和甲酯結(jié)構(gòu),最終生成無活性的保幼激素酸二醇(JH acid diol)[3]。

早期昆蟲JH降解活性的研究主要以JHE為主[4]。但不同研究也發(fā)現(xiàn),JHEH在JH的降解代謝中同樣扮演了重要的角色[5-6]。與JHE相比,JHEH的重要作用表現(xiàn)在兩方面:① JHEH是一種非分泌酶,能在各發(fā)育階段的各個組織中降解保幼激素以調(diào)節(jié)其適宜濃度;② JHEH降解保幼激素生成的保幼激素二醇(JH diol)是一種不可逆的代謝產(chǎn)物,而通過JHE的降解產(chǎn)物保幼激素酸可以被重新利用合成保幼激素[7]。JHEH作用的重要性往往存在物種和時期特異性。例如在黑果蠅(Drosophilavirilis)中,JHE一直是其生命周期中主要的JH降解酶;而在同屬的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中,其蛹期發(fā)育至成體這一過程中的JH降解則需要JHE和JHEH的共同參與,JHEH更是在成體期起著主要的JH降解作用[8]。JHEH基因目前已在家蠶(Bombyxmori)[9]、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)[10]、意蜂(Apismellifera)[11]等多種昆蟲中被克隆得到。JHEH的氨基酸序列均包含一個由天冬氨酸、組氨酸和谷氨酸(或者天冬氨酸)構(gòu)成的保守催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)是環(huán)氧化合物水解酶的核心結(jié)構(gòu)域,能夠協(xié)助酶分子與底物的結(jié)合[12]。

近年來,JHEH的同源序列陸續(xù)在一些甲殼動物物種中被發(fā)掘[13-14]。這些JHEH序列與昆蟲JHEH具有較高的一致性,都含有保守的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu),表明了其具有催化環(huán)氧化物的潛在能力。但有意思的是,甲殼動物體內(nèi)并沒有任何形式的JH,而是利用一種不含環(huán)氧結(jié)構(gòu)的甲基法尼酯(Methyl farnesoate,MF)執(zhí)行類似于JH的功能[15]。JHEH是否參與甲殼動物MF的降解代謝目前還缺乏定論。李真真[13]在日本沼蝦(Macrobrachiumnipponens)中擴增得到了JHEH基因的全長cDNA序列,并且組織表達(dá)顯示其在肝胰腺中表達(dá)水平最高。由于肝胰腺是MF降解代謝的主要組織,JHEH基因在肝胰腺的高表達(dá)被認(rèn)為可能和MF降解有關(guān)。趙明等[14]在擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)中也報道了類似的結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)JHEH基因在卵巢的未發(fā)育期到近成熟期表達(dá)較低,但在成熟期的肝胰腺和排卵后期的卵巢中則顯著升高,因此，認(rèn)為JHEH可能參與卵巢發(fā)育的調(diào)控。

為了進(jìn)一步明確JHEH在甲殼動物中的作用,本研究對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的JHEH基因全長cDNA進(jìn)行了分子克隆,并分析了其在不同組織及卵巢發(fā)育和蛻皮過程中的表達(dá)水平變化。三疣梭子蟹是我國東南沿海一種重要的經(jīng)濟蟹類。寧波大學(xué)甲殼動物發(fā)育生物學(xué)課題組在之前的研究中已經(jīng)探明了蛻皮及卵巢發(fā)育過程中血淋巴MF的濃度變化[16-18]。通過比較分析JHEH基因表達(dá)與MF濃度水平的關(guān)系,本研究探討了JHEH在MF代謝通路中的可能作用,不僅為闡明JHEH的功能奠定了理論基礎(chǔ),也將有助于完善甲殼動物蛻皮及卵巢發(fā)育的內(nèi)分泌調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取健康的野生三疣梭子蟹,暫養(yǎng)在寧波市海洋與漁業(yè)研究院苗場實驗基地,每日投喂鮮活的蟶子。參照沈潔等[19]的方法,根據(jù)形態(tài)學(xué)的特征變化,將三疣梭子蟹蛻皮周期劃分為蛻皮后期(A、B期)、蛻皮間期(C期)、蛻皮前期(D0、D1、D2、D3和D4亞期)和蛻皮期(E期)共4個階段,采集蛻皮間期(甲寬13.3～16.7 cm,體質(zhì)量180～240 g)的雌雄三疣梭子蟹的肝胰腺、卵巢、精巢、Y器、鰓、肌肉、腸、胸神經(jīng)節(jié)、眼柄、腦、大顎器、表皮、心臟用于PtJHEH組織差異表達(dá)分析。再采集各蛻皮期三疣梭子蟹(E期除外)(甲寬8～12 cm、體質(zhì)量42～83 g),取肝胰腺和Y器,用于分析PtJHEH在蛻皮周期中表達(dá)水平變化,每個蛻皮期分別取5只螃蟹作為生物學(xué)重復(fù),采集的組織暫時轉(zhuǎn)移到RNA保護(hù)液(康為世紀(jì))中,在-20 ℃中保存。根據(jù)性腺指數(shù)(GSI)和卵巢外部特征將三疣梭子蟹第2次卵巢發(fā)育劃分為4個階段,分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期[20],采集各個卵巢發(fā)育階段的三疣梭子蟹(甲寬14.2～17.3 cm;體質(zhì)量170～350 g)的肝胰腺和Y器組織,用于第2次卵巢發(fā)育過程中PtJHEH表達(dá)水平的變化,采集的組織暫時轉(zhuǎn)移到RNA保護(hù)液中,在-20 ℃中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 將上述保存在RNA保護(hù)液中的樣品組織移到300 μL的TRIzol溶液(上海生工)中,按照TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。總RNA經(jīng)DNase Ⅰ(康為)去除基因組DNA后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,并用超微量分光光度計Nanodrop 2000C(ThermoFisher)進(jìn)行純度分析。用PrimerScript RT reagant Kit 試劑盒(康為)將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA,保存于-20 ℃。

1.2.2 全長cDNA克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中JHEH的同源序列,設(shè)計特異性引物(表1),總體系為25 μL,擴增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,33個循環(huán);72 ℃再延伸10 min,反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后,根據(jù)DNA回收試劑盒(生工)說明書進(jìn)行回收和純化。純化的DNA與pMD-18T載體(TaKaRa)連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa)中進(jìn)行擴大培養(yǎng)。利用菌落PCR挑選陽性克隆,送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果,比對轉(zhuǎn)錄組序列,確定序列正確后,設(shè)計特異性引物(表1),利用RACE技術(shù)對3′和5′端的序列進(jìn)行擴增。分別取1 μg肝胰腺總RNA,按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)說明書對3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA進(jìn)行合成。分別以上述cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴增,總體系為25 μL,擴增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,33個循環(huán);72 ℃再延伸10 min,反應(yīng)結(jié)束,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確定后,按照上述步驟對其進(jìn)行回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化和測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果利用Vector NTI 10.0對序列進(jìn)行拼接,獲得三疣梭子蟹JHEH(PtJHEH)的全長cDNA序列,利用NCBI ORF Finder 在線工具確定PtJHEH的開放閱讀框ORF序列,并翻譯成氨基酸序列。利用ProParam tool分析預(yù)測氨基酸基本理化性質(zhì);使用Signal 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/)分析蛋白質(zhì)信號肽;利用在線TMHMM工具預(yù)測氨基酸跨膜區(qū)域,使用SMART程序分析氨基酸結(jié)構(gòu)。采用在線工具Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用Expasy(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)對蛋白質(zhì)的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測;利用NCBI BlastP在線搜索不同物種的同源序列,使用ClustalX軟件進(jìn)行多重序列比對;挑選具有代表性的物種的JHEH氨基酸序列,使用MEGA 5.0 軟件的鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實時熒光定量(RT-qPCR) 根據(jù)已經(jīng)獲得PtJHEH基因的cDNA全長序列設(shè)計一對特異性引物PtJHEH-q-F和PtJHEH-q-R(表1),以β-actin-F和β-actin-R(表1)作為內(nèi)參引物利用qPCR對PtJHEH基因進(jìn)行表達(dá)水平分析。擴增條件為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s,58 ℃ 20 s,68 ℃ 20 s,共40個循環(huán);95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,升溫25 min,95 ℃ 15 s。各樣品中目的基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算,以其中一個樣品中的表達(dá)水平為參照,其他樣品中的表達(dá)水平則以其倍數(shù)表示。

表1 PtJHEH擴增及表達(dá)所用引物

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,利用Statistical Product and Service Solutions(SPSS)20.0軟件對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性進(jìn)行分析。結(jié)果首先用Kolmogorov-Smirnov and Cochran對其方差齊性進(jìn)行檢驗,若方差不齊,則用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗法分析;若方差整齊,則用Duncan或t檢驗法分析。分析結(jié)果P<0.05表示顯著性差異,用不同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹JHEH基因的克隆及蛋白的結(jié)構(gòu)分析

使用引物PtJHEH-F和PtJHEH-R得到的產(chǎn)物,經(jīng)過測序顯示該片段長度為1 374 bp(圖1-A),用引物PtJHEH-3′F1和PtJHEH-3′F2進(jìn)行3′-RACE得到的產(chǎn)物,經(jīng)過測序顯示該片段長度為108 bp(圖1-B)。用PtJHEH-5′R1和Outer primer引物先進(jìn)行第1輪PCR擴增,再以該PCR產(chǎn)物為模板,用PtJHEH-5′R2和Inner primer 引物進(jìn)行第2輪PCR擴增,得到5′-RACE的產(chǎn)物,測序結(jié)果顯示該片段為321 bp(圖1-C)。將測序得到的序列進(jìn)行拼接,結(jié)果得到長度為1 803 bp(圖2),該序列GenBank登錄號為KU216465,該基因的5′非編碼區(qū)為321 bp,3′非編碼區(qū)為108 bp,開放閱讀框(ORF)為1 374 bp,編碼467個氨基酸。

從左到右的DNA Marker分別是DL2000、DL500和DL1000。

ORF用大寫表示;信號肽用下劃線標(biāo)出;保守特征位點用灰色背景標(biāo)出;起始密碼用方框框出;星號表示終止密碼。

生物信息學(xué)分析顯示,PtJHEH分子式為C2367H3624N614O634S13,分子質(zhì)量為51.24 ku,等電點(pI)為8.58,不穩(wěn)定系數(shù)為35.63,含有負(fù)電荷氨基酸殘基42個,正電荷氨基酸殘基45個。利用SignalP對編碼區(qū)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹JHEH有25個氨基酸殘基的信號肽(圖3-A),表明三疣梭子蟹JHEH屬于分泌蛋白。使用TMHMM工具分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列具有跨膜結(jié)構(gòu)(圖3-B),跨膜結(jié)構(gòu)域位于第20-37個氨基酸的位置。預(yù)測PtJHEH的三級結(jié)構(gòu)(圖3-C)發(fā)現(xiàn),PtJHEH中包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。對PtJHEH氨基酸序列的親水性/疏水性進(jìn)行預(yù)測(圖3-D)發(fā)現(xiàn),PtJHEH氨基酸序列中的親水性氨基酸占比要高于疏水性氨基酸,故PtJHEH為親水性蛋白。

A.蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測;B.蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測;C.蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;D.蛋白質(zhì)親水性/疏水性預(yù)測。

2.2 三疣梭子蟹JHEH氨基酸多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

選取擬穴青蟹(SpJHEH)、羅氏沼蝦(MrJHEH)和凡納濱對蝦(LvJHEH),還有具有代表性的昆蟲中的家蠶(BmJHEH)和黑腹果蠅(DmJHEH)的氨基酸序列與三疣梭子蟹JHEH氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對分析(圖4),結(jié)果顯示，氨基酸序列共同包括N-末端的膜錨定位點“XWG”、催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)(Asp225、Glu404和His431)、酪氨酸殘基(Tyr297和Tyr375)和“HGWP”花樣結(jié)構(gòu),PtJHEH與其他物種的JHEH都具有典型的環(huán)氧化酶催化結(jié)構(gòu)域。

劃線部分表示信號肽；方框里的是保守特征位點；三角形代表N-末端的膜錨定位點“XWG”。

利用MEGA 5.0軟件,將PtJHEH的氨基酸序列與其他物種的JHEH氨基酸序列通過鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5),結(jié)果顯示，三疣梭子蟹JHEH與甲殼動物的擬穴青蟹JHEH最為接近,其同源性為90.83%,其次是與羅氏沼蝦的同源性為67.46%,與凡納濱對蝦的同源性為61.39%。三疣梭子蟹JHEH與其他甲殼類動物的JHEH聚為一支,與其傳統(tǒng)的分類地位相吻合,說明PtJHEH氨基酸序列在進(jìn)化上保守性強。

圖5 三疣梭子蟹JHEH氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 PtJHEH在三疣梭子蟹不同組織中的表達(dá)差異

實時熒光定量結(jié)果顯示,PtJHEH在雌雄各組織中均有不同程度的表達(dá)(圖6),其中表達(dá)量最高的組織是肝胰腺,與其他組織有顯著性的差異,其次是Y器。

IN.腸;TG.胸神經(jīng)節(jié);HP.肝胰腺;HT.心臟;BR.腦;MS.肌肉;ES.眼柄;YO.Y器;MO.大顎器;EP.皮;OV.卵巢;TE.精巢;GI.鰓。不同字母表示雌雄組內(nèi)的不同組織之間的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。

2.4 PtJHEH在蛻皮周期中的表達(dá)水平變化

鑒于PtJHEH在雌雄蟹肝胰腺和Y器中表達(dá)量均是最高,選取三疣梭子蟹肝胰腺和Y器作為試驗材料研究PtJHEH在蛻皮周期中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示(圖7):肝胰腺中PtJHEH在各個時期均有表達(dá),從蛻皮后期(A和B)至蛻皮前期D0亞期,呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢,在D0期降到最低,之后從D0期開始逐漸上升,至D2期升至最大,之后迅速回落,保持較低的表達(dá)水平;Y器中PtJHEH從蛻皮間期(C)至蛻皮前期D4亞期的相對表達(dá)量一直較低,而蛻皮后期中的A期至B期呈現(xiàn)上升趨勢,在B期升至最大,并與其他時期相比具有顯著性差異。

不同字母表示蛻皮周期各期表達(dá)水平有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 PtJHEH在第2次卵巢發(fā)育階段中的表達(dá)水平變化

實時熒光定量結(jié)果顯示(圖8),在三疣梭子蟹第2次卵巢發(fā)育過程中,肝胰腺中PtJHEH的表達(dá)水平變化在Ⅰ期和Ⅱ期表達(dá)量較低,在Ⅱ期有略微下降,至Ⅲ期表達(dá)量顯著增大(P<0.05),之后Ⅳ期略有下降。Y器中PtJHEH的表達(dá)水平變化在Ⅰ期至Ⅲ期呈現(xiàn)出上升趨勢,Ⅲ期升至最大,之后Ⅳ期迅速回落。

不同字母表示卵巢發(fā)育不同發(fā)育期之間表達(dá)水平有顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本研究克隆得到了PtJHEH的全長cDNA序列,該序列全長1 803 bp,包括1 374 bp的開放閱讀框、321 bp的5′端非編碼區(qū)和108 bp的3′端非編碼區(qū),編碼467個氨基酸。通過對三疣梭子蟹JHEH氨基酸序列與近源物種同源性的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),該序列具有JHEH所有的結(jié)構(gòu)域特征,包括催化三聯(lián)體(Asp225、Glu404和His431)、構(gòu)成陰離子的殘基(Tyr297和Tyr375)和“HGWP”花樣結(jié)構(gòu)。這表明PtJHEH是一個典型的環(huán)氧化合物水解酶,具有催化活性。另外,在N末端有高度保守的“XWG”固定位點,在家蠶中被認(rèn)為是亞細(xì)胞定位的膜錨著點。但是在真菌、細(xì)菌和原生動物中不存在[21]。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),三疣梭子蟹JHEH與其他甲殼動物的JHEH親緣關(guān)系較近,符合其傳統(tǒng)的分類地位。

組織表達(dá)結(jié)果顯示,PtJHEH在肝胰腺中的表達(dá)水平最高,與日本沼蝦[13]和擬穴青蟹[14]的結(jié)果一致。肝胰腺是MF代謝的主要組織,MF酯酶的酶活及基因表達(dá)都在肝胰腺中最高[22-23]。然而,JHEH的高表達(dá)是否與MF有關(guān)還需要進(jìn)一步證實。事實上,在意蜂(Apismellifera)中,JHEH并無JH降解活性,但是卻在脂肪代謝中發(fā)揮作用[11]。肝胰腺是甲殼動物物質(zhì)代謝的主要場所[24],JHEH在肝胰腺中的高表達(dá)也可能與其參與其他物質(zhì)的代謝過程有關(guān)。除肝胰腺外,PtJHEH在Y器中也有較高表達(dá)。Y器是甲殼動物產(chǎn)生蛻皮激素的主要位點,而蛻皮激素的合成又可能受到MF的調(diào)控[25]。由于JHEH是一種非分泌酶,如果JHEH存在對MF的調(diào)控作用,其可能在Y器中表達(dá)控制細(xì)胞中MF的含量,以確保合適的蛻皮激素合成速率。

為了進(jìn)一步明確JHEH與MF的關(guān)系,檢測了蛻皮周期及卵巢發(fā)育過程肝胰腺和Y器里PtJHEH的表達(dá)水平變化。在蛻皮周期中,肝胰腺中PtJHEH的表達(dá)變化與之前報道的血淋巴MF濃度及其合成酶基因表達(dá)的變化在蛻皮前期存在一定相關(guān)性,后兩者均在蛻皮前期D1亞期[26],略早于PtJHEH表達(dá)的高峰。這說明PtJHEH可能響應(yīng)MF進(jìn)行表達(dá),以調(diào)控機體正常的MF濃度。但在蛻皮后期(A和B),血淋巴MF濃度及其合成酶基因的表達(dá)都處于較低水平,而PtJHEH卻保持了穩(wěn)定的表達(dá),說明PtJHEH可能有MF之外的作用對象。而在Y器中,PtJHEH在A和B期顯著高表達(dá),也與此時較低的血淋巴MF濃度[25]和蛻皮激素濃度保持一致[27]。

在卵巢發(fā)育過程中,肝胰腺和Y器里PtJHEH的表達(dá)水平變化較為一致,均是在前卵黃合成期(Ⅰ期)和卵黃合成早期(Ⅱ期)較低,而在卵黃合成晚期(Ⅲ期)和成熟期(Ⅳ期)顯著上升。該變化趨勢與擬穴青蟹報道的JHEH在卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)變化相似[14],也和已報道的卵巢發(fā)育過程中血淋巴MF濃度[25]和蛻皮激素的濃度[28]保持了一致。這個結(jié)果也再一次表明了JHEH可能參與MF濃度的調(diào)控。值得注意的是,MF并沒有環(huán)氧結(jié)構(gòu),JHEH對MF無法產(chǎn)生直接的催化降解作用,因此，可能還存在其他的調(diào)控機制實現(xiàn)JHEH與MF的聯(lián)系。近年來,在一些甲殼動物物種中發(fā)現(xiàn)了昆蟲MF的環(huán)氧化酶CYP15A1的存在,本課題組近期在研究三疣梭子蟹CYP15A1時也發(fā)現(xiàn)其在肝胰腺、卵巢、Y器等組織中均有表達(dá)。因此,MF極有可能在這些器官中進(jìn)一步被環(huán)氧化成JH,進(jìn)而被JHEH催化降解。

總之,本研究對三疣梭子蟹JHEH基因的全長cDNA進(jìn)行了分子克隆并分析了其在不同組織及卵巢發(fā)育和蛻皮過程中的表達(dá)水平變化。通過比較分析蛻皮及卵巢發(fā)育過程中JHEH基因表達(dá)模式與MF濃度變化的關(guān)系,本研究探討了JHEH在MF代謝通路中的可能作用,為今后闡明JHEH的功能奠定了理論基礎(chǔ),也有助于進(jìn)一步完善甲殼動物蛻皮及卵巢發(fā)育的內(nèi)分泌調(diào)控機制。