劉小政 苑慶華 夏斌 張美嬌 劉小鄖

【摘要】目的：通過對(duì)血清中新型冠狀病毒1gM和IgG抗體的定性檢測(cè)，探索新型冠狀病毒1gM/gG抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）的臨床診斷價(jià)值。方法：本研究以2020年1月3日至2020年3月19日于十堰市西苑醫(yī)院收治的新型冠狀病毒肺炎感染確診患者141例和141名健康體檢者為研究對(duì)象，采用膠體金免疫層析技術(shù)對(duì)患者血清中的新型冠狀病毒IgG和IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：141例患者均為新型冠狀病毒肺炎確診患者，血清IgG抗體檢測(cè)的臨床敏感度為87.2%（123/141）;血清IgM抗體檢測(cè)的臨床敏感度為69.5%（98/141）;血清IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)的臨床敏感度為90.1%（127/141）。141名健康體檢者為新型冠狀病毒肺炎排除者，血清IgG、IgM抗體檢測(cè)的臨床特異性均為100%（141/141）。結(jié)論：血清IgM/IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)可對(duì)新型冠狀病毒感染者進(jìn)行有效篩查，并對(duì)健康人群進(jìn)行高效排除檢測(cè)，IgM/IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)是新型冠狀病毒感染的輔助診斷方法。

【關(guān)鍵詞】新型冠狀病毒;IgG抗體檢測(cè);IgM抗體檢測(cè);臨床應(yīng)用價(jià)值

[中圖分類號(hào)]R446.6;8563.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2021）01-0146-03

新型冠狀病毒（2019-nCoV）為單鏈正股RNA病毒，疫情來勢(shì)洶洶，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康安全，對(duì)公共衛(wèi)生防御體系帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。新冠疫情的控制，早期快速檢測(cè)，及時(shí)診斷治療是關(guān)鍵，根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）[1-3]，新冠病例確診要求仍為疑似病例具備以下病原學(xué)證據(jù)之一者：實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽性;病毒基因測(cè)序，與已知的新型冠狀病毒高度同源[4-5]。病毒核酸RT-PCR檢測(cè)已成為目前診斷新冠感染的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，然而在應(yīng)用的過程中也暴露了其局限性[6]：檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜;需要經(jīng)過認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室、昂貴的設(shè)備和經(jīng)過培訓(xùn)的技術(shù)人員才能操作;由于采樣、核酸提取不易標(biāo)準(zhǔn)化等原因，存在假陰性問題。這些限制使得核酸RT-PCR檢測(cè)不適合在現(xiàn)場(chǎng)用于快速簡(jiǎn)單的診斷及患者篩查。因此迫切需要快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來快速鑒別新冠感染患者，保證患者得到及時(shí)治療，有效防控疫情。通常情況下，病原感染機(jī)體后，Igm抗體產(chǎn)生早，一經(jīng)感染，快速產(chǎn)生維持時(shí)間短，消失快，血液中檢測(cè)陽性可作為早期感染的指標(biāo)[7-9]。IgG抗體產(chǎn)生晚，維持時(shí)間長(zhǎng)，消失慢，血液中檢測(cè)陽性可作為感染和既往感染的指標(biāo)。雖然，目前對(duì)于新型冠狀病毒的Igm和1gG的產(chǎn)生和持續(xù)時(shí)間尚缺乏系統(tǒng)性研究，但參考SARS感染后3～6d可在患者血液中檢測(cè)到Igm抗體，8d后檢測(cè)到1gG抗體，而SARS與新冠病毒同屬一個(gè)大家族，因此認(rèn)為新冠病毒特異性Igm和IgG抗體快速檢測(cè)將為新冠感染患者的診斷和治療提供有力支持?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第七版）將血清新型冠狀病毒IgG和I gm抗體陽性;血清新型冠狀病毒特異性1gG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高納入確診標(biāo)準(zhǔn)?！盾婈?duì)支援湖北醫(yī)療隊(duì)新型冠狀病毒感染疾病診療方案（第一版試行）》中，血清特異性I gm抗休檢測(cè)陽性已經(jīng)納入確診標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年1月3日至2020年3月19日于十堰市西苑醫(yī)院收治的新型冠狀病毒肺炎確診患者141例，實(shí)驗(yàn)室病毒核酸檢測(cè)均為陽性，符合《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，141例患者中男性67例、女性74例，年齡8～89歲;141例健康體檢者中男性83例、女性58例，年齡3～89歲。本研究已經(jīng)患者知情同意。

1.2 材料與試劑 新型冠狀病毒Igm和IgG抗體檢測(cè)試劑條（膠體金法）購(gòu)自天津喜諾生物醫(yī)藥有限公司。離心機(jī)購(gòu)自北京白洋醫(yī)療器械有限公司。一次性真空采血管購(gòu)自蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 空腹采集靜脈血4mL，3000rpm/min離心10min，取血清備用。血清新型冠狀病毒Igm和IgG抗體檢測(cè)試劑條采用膠體金免疫層析技術(shù)，檢測(cè)步驟參照說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下：分別取10μL待測(cè)樣本于酶標(biāo)板中，滴2～3滴樣本稀釋液對(duì)樣本進(jìn)行10倍稀釋;取檢測(cè)試紙條插入已稀釋的待測(cè)樣本中，等待10min判定結(jié)果。

結(jié)果判讀方法：T線和C線均出現(xiàn)紅色條帶，表明檢測(cè)結(jié)果為陽性;僅C線出現(xiàn)紅色條帶表明檢測(cè)結(jié)果為陰性;若C線未出現(xiàn)紅色條帶，則說明檢測(cè)無效并重新檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4.1 靈敏度、特異度、總符合率 根據(jù)考核試劑檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果，計(jì)算考核試劑的靈敏度和特異度。

①靈敏度：a/（a+c）*100%

②特異度：d/（b+d）*100%

③總符合率：（a+d）/（a+b+c+d）*100%

其中：

a：臨床診斷結(jié)果為確診，考核試劑結(jié)果為陽性的結(jié)果;

b：臨床診斷結(jié)果為排除，考核試劑結(jié)果為陽性的結(jié)果;

c：臨床診斷結(jié)果為確診，考核試劑結(jié)果為陰性的結(jié)果;

d：臨床診斷結(jié)果為排除，考核試劑結(jié)果為陰性的結(jié)果;

1.4.2 Kappa分析 對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性分析，Kappa系數(shù)≥0.75，為高度一致，認(rèn)為兩系統(tǒng)等效;Kappa系數(shù)≥0.4，認(rèn)為一致;Kappa系數(shù)<0.4，則認(rèn)為兩系統(tǒng)不一致，兩系統(tǒng)不等效。

Kappa系數(shù)計(jì)算公式如下：

Kappa=（PA-Pe）/（1-Pe）

其中：PA為“實(shí)際一致率”，Pe為“理論一致率”。以表1為例，計(jì)算方法如下：PA=（a+d）/（a+b+c+d）

Pe=[（a+b）（a+c）+（c+d）（b+d）]/（a+b+c+d）2

1.4.3 亞組分析 針對(duì)不同病程階段的患者（急性期和恢復(fù)期）參照上述方法進(jìn)行分層分析。

1.4.4 窗口期分析 針對(duì)新型冠狀病毒感染的肺炎患者不同時(shí)間采集的連續(xù)樣本，對(duì)比核酸檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)考核試劑對(duì)新型冠狀病毒感染的檢出能力和窗口期。

1.4.5 1gG和IgM聯(lián)合檢測(cè)評(píng)價(jià) 為評(píng)價(jià)IgG和IgM聯(lián)合檢測(cè)的臨床意義，針對(duì)1gG抗體和IgM抗體檢測(cè)結(jié)果參照上述方法進(jìn)行兩項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果描述本中心篩選樣本282例，排除。例，人選282例，剔除。例，完成282例

完成樣本282例，其中臨床診斷陽性樣本141例，臨床診斷陰性樣本141例。141例陽性樣本中，IgM檢出98例，IgG檢出123例，IgM/IgG檢出127例。141例陰性樣本中，Igm，IgG檢測(cè)均為陰性。

2.2 結(jié)果分析

2.2.1 靈敏度、特異度、總符合率 根據(jù)考核試劑檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果，計(jì)算考核試劑的靈敏度和特異度。

Igm：靈敏度=98/141*100%=69.50%

特異度=141/141 *100%=100.00%

IgG：靈敏度=123/141*100%=87.20%

特異度=141/141*100%=100.00%

IgM/IgG：靈敏度=127/141*100%=90.10%

特異度=141/141*100%=100.00%

總符合率=（127+141）/282*100%=95.03%

2.2.2 Kappa分析

IgMPA=（98+141）/（（98+0+43+141）=0.848

Pe=（98*141+184*141）/282*282=0.5

Kappa =（0.848-0.5）/（1-0.5）=0.695，結(jié)果一致

IgG PA=（123+141）/（123+0+18+141）=0.936

Pe=（123*141+159*141）/282*282=0.5

Kappa=（0.929-0.5）/（1-0.5）=0.872，結(jié)果高度一致

IgM/IgG PA=（127+141）/（127+0+14+141）-0.950

Pe=（127*141+155*141）/282*282-0.5

Kappa-（0.950-0.5）（1-0.5）-0.901，結(jié)果高度一致

2.2.3 亞組分析 為方便統(tǒng)計(jì)，針對(duì)141例臨床診斷結(jié)果均為陽性的樣本，依照取樣時(shí)間人為劃分為早期（7d），中期（7～14d），后期（>14d），結(jié)果顯示，141例患者中，處于早期的患者有3例，其中Igm單獨(dú)陽性3個(gè)，該結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道一致;處于中期的患者有86例，84例患者Igm和IgG同時(shí)陽性，1例患者Igm單獨(dú)陽性，1例患者Igm和1gG同時(shí)陰性;處于后期的患者有52例，其中Igm陽性11例，1gG陽性39例，經(jīng)核查大部分患者處于康復(fù)中后期，試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)告基本一致。

2.2.4 IgG和Igm聯(lián)合檢測(cè)評(píng)價(jià) 通過對(duì)141例臨床診斷結(jié)果均為陽性的樣本進(jìn)行檢測(cè)，Igm檢出陽性98例，敏感度為41.30%;1gG檢出陽性55例，敏感度73.30%;IgM/IgG檢出陽性56例，敏感度74.70%;結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)Igm和1gG抗體，診斷效果更佳。

3 討論

國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1-3]中增加血清新型冠狀病毒特異性Igm抗體和IgG抗體陽性作為血清學(xué)確診證據(jù)之一。血清特異性抗體是集體免疫系統(tǒng)抵抗病毒的重要效應(yīng)分子，檢測(cè)新型冠狀病毒IgG和Igm抗體，補(bǔ)充核酸檢測(cè)診斷不足從而減少病毒核酸檢測(cè)假陰性的漏檢，提高新型冠狀病毒感染的診斷率;判斷病毒感染時(shí)期，為監(jiān)測(cè)患者的病程和指導(dǎo)用藥提供依據(jù)。本研究針對(duì)141例確診的新型冠狀病毒患者同時(shí)進(jìn)行了新型冠狀病毒IgG和Igm抗體檢測(cè)，血清IgG抗體臨床檢測(cè)率87.2%，血清Igm抗體臨床檢出率69.5%，IgG抗體臨床檢測(cè)率高于血清Igm抗體臨床檢出率且Kappa值結(jié)果一致性更高。Igm產(chǎn)生早、維持時(shí)間短、親和力低是早期感染的指標(biāo)，而IgG產(chǎn)生晚、維持時(shí)間長(zhǎng)、消失慢是感染和既往感染的指標(biāo)。針對(duì)141例臨床診斷結(jié)果均為陽性的樣本，依照取樣時(shí)間人為劃分為早期（≤7d），中期（7～14d），后期（>14d），分析各個(gè)時(shí)期患者IgM/IgG抗體檢測(cè)結(jié)果規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)告基本一致，因此開展抗體動(dòng)態(tài)檢測(cè)有助于判斷患者感染時(shí)期，實(shí)時(shí)掌握患者病毒感染進(jìn)程。同時(shí)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IgG和Igm抗體聯(lián)合檢測(cè)臨床檢出率為90.1%，均高于單獨(dú)抗體檢測(cè)的檢出率，因此我們建議在臨床應(yīng)用中將IgG和IgM進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，提高臨床檢出率。

本研究采用的抗體檢測(cè)方法為膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromtographic assay，GICA），是以膠體金為示蹤標(biāo)志物，對(duì)抗原抗體進(jìn)行檢測(cè)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)[10]。該檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏，無需特殊操作人員及檢測(cè)設(shè)備，操作簡(jiǎn)單且反應(yīng)快速，10min內(nèi)即可觀察檢測(cè)結(jié)果。

綜上，新型冠狀病毒IgG和IgM抗體檢測(cè)可廣泛應(yīng)用于各級(jí)醫(yī)院、社區(qū)、門診等醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)大容量人群的快速感染初篩，以及感染患者持續(xù)IgG/IgM動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)價(jià)。抗體聯(lián)合檢測(cè)有效解決檢測(cè)成本高、時(shí)間長(zhǎng)等難題，實(shí)現(xiàn)有效補(bǔ)充病毒核酸檢測(cè)，將在新型冠狀病毒肺炎的診斷、排除、治療、監(jiān)測(cè)和病程轉(zhuǎn)歸等方面對(duì)臨床診療提供更多的參考。

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*通信作者：劉小鄖，十堰市疾病控制中心。