添加不同濃度黑曲霉菌液對飼用苧麻混合青貯品質(zhì)影響

鄧薈芬, 劉 艷, 揭紅東, 馬玉申, 何鵬亮, 黃麗娟, 林子群,邢虎成, 揭雨成*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南省草類作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410125；3. 湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127)

苧麻(Boehmerianivea) 是蕁麻科苧麻屬多年生作物[1]，是傳統(tǒng)的纖維作物。在我國南方，高蛋白飼草缺乏，嚴(yán)重制約著畜牧業(yè)的發(fā)展。苧麻的蛋白質(zhì)含量高，年生物產(chǎn)量大，有望成為今后重要的植物蛋白質(zhì)飼料來源[2]。但是，苧麻含有大量木質(zhì)纖維素，工業(yè)化加工困難，動(dòng)物消化吸收困難，尋求能高效降解苧麻木質(zhì)纖維素的方法至關(guān)重要。青貯是對苧麻安全保存的有效方法，并且在發(fā)酵過程中可以進(jìn)行木質(zhì)纖維素的生物降解。青貯過程中添加纖維素酶制劑，可以降解木質(zhì)纖維素含量，提高家畜利用效率[3]。但是酶制劑成本高，降解效果有限[4]，不適于大規(guī)模生產(chǎn)使用。

近年來，高產(chǎn)纖維素酶微生物的研究受到高度關(guān)注。曲霉菌屬是絲狀真菌中著名的高產(chǎn)纖維素酶菌屬之一，黑曲霉(Aspergillusniger)屬于曲霉菌屬，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、木質(zhì)素降解酶等多種酶[5-6]，多種酶共同作用可以高效降解生物質(zhì)，且安全、無毒素。任付平等[7]通過添加黑曲霉菌等對玉米(Zeamays)進(jìn)行青貯，處理組中性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)和酸性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)的含量比對照組分別降低了13.81%和12.67%。

劉洋等[8]在苜蓿(Medicago)鮮草中添加麥麩進(jìn)行青貯可以控制青貯水水分，提高營養(yǎng)品質(zhì)，ADF和NDF含量顯著低于添加統(tǒng)糠的處理，本試驗(yàn)在混合青貯中通過添加麥麩來調(diào)節(jié)青貯原料的含水量。本研究通過添加不同濃度(質(zhì)量體積比)黑曲霉菌液對飼用苧麻與麥麩進(jìn)行混合發(fā)酵，探究不同濃度黑曲霉菌液對飼用苧麻青貯營養(yǎng)成分、品質(zhì)和木質(zhì)纖維素降解效果的影響，尋求黑曲霉菌液最佳添加量，并通過研究在發(fā)酵過程中主要幾種相關(guān)酶活的動(dòng)態(tài)變化，為黑曲霉菌在青貯中降解植物木質(zhì)纖維素的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)青貯苧麻原料為‘湘飼纖兼用1號’，在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地種植。收割時(shí)間2018年5月20日，刈割高度株高60 cm左右，全株切碎至1～2 cm待用。麥麩由臨泉縣金禾面粉有限公司生產(chǎn)，白砂糖購自湖北惠林食品有限公司，青貯原料營養(yǎng)成分見表1。黑曲霉由本實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 青貯原料營養(yǎng)成分Table 1 Nutrition content compositions of ensilage materials

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。在每千克苧麻與麥麩(80%苧麻+18%麥麩+2%蔗糖)混合青貯中分別添加50 mL黑曲霉菌液(濃度為5.68×106CFU·mL-1)+150 mL無菌水(Ⅰ)、100 mL黑曲霉菌液+100 mL無菌水(Ⅱ)、150 mL黑曲霉菌液+50 mL無菌水(Ⅲ)、200 mL黑曲霉菌液(Ⅳ)、200 mL無菌水為對照組(CK)，每組6個(gè)重復(fù)。

按最佳處理配方將青貯材料混合均勻后裝入青貯袋中，抽真空后封口。常溫下青貯0 d，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，15 d，30 d后開包，對青貯材料進(jìn)行酶活檢測，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定3個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成：麩皮40 g·L-1，豆粉餅15 g·L-1，(NH4)2SO45 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，MgSO4·7H2O22 g·L-1。將黑曲霉菌用接種環(huán)接種到PDA液體培養(yǎng)基中，放置于振蕩培養(yǎng)箱中32℃，170～180 r·min-1培養(yǎng)6 d。

黑曲霉計(jì)數(shù)：在接種液中加入玻璃珠，振蕩器振蕩后用3層紗布紗布過濾，過濾得到孢子懸浮液，然后用無菌水對其逐級稀釋，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到黑曲霉孢子濃度。黑曲霉菌液濃度為5.68×106CFU·mL-1。

培養(yǎng)結(jié)束后1～2 h內(nèi)將不同濃度黑曲霉菌液均勻噴灑在青貯料上并攪拌均勻，青貯材料放入聚乙烯真空袋中抽真空密封后進(jìn)行發(fā)酵。每袋400 g，室溫條件下發(fā)酵30 d后開包進(jìn)行檢測。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

干物質(zhì)(Dry matter,DM)、粗脂肪(Ether extract,EE)、粗蛋白(Crude protein,CP)含量檢測方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)(第4版)》[9]。蒽酮比色法[10-11]測定可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates,WSC)。范氏洗滌纖維法[12-13]測定酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌木質(zhì)素(Acid detergent lignin,ADL)含量。

利用pH計(jì)(雷磁PHS-3C型)測定pH[14]；氨態(tài)氮(Ammoniacal nitrogen,NH3-N)采用苯酚-次氯酸比色法測定[15]；氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸(Volatile Fatty Acid,VFA)[16]；參照V-Score評分體系及V-Score分?jǐn)?shù)分配計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)對各處理進(jìn)行評分[17]。對不同發(fā)酵時(shí)間的青貯進(jìn)行酶活檢測。青貯羧甲基纖維素酶(Carboxymethyl cellulose,CMC)活性檢測方法參考索萊寶CMC活性檢測試劑盒說明書；錳過氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)活性檢測方法參考索萊寶Mnp活性檢測試劑盒說明書；漆酶活性檢測方法參考索萊寶漆酶活性檢測試劑盒說明書；木聚糖酶活性檢測方法參考索萊寶木聚糖酶活性檢測試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表2可知，與對照組相比，各處理組的DM，WSC含量都有顯著升高(P<0.05)，且處理Ⅰ組、處理Ⅱ組DM，WSC含量顯著高于處理Ⅲ組和處理Ⅳ組(P<0.05)；各處理組與對照組間CP及EE含量無顯著差異；與對照組相比，處理Ⅱ組、處理Ⅲ組和處理Ⅳ組的ADF，NDF和ADL含量顯著降低(P<0.05)。

表2 各處理青貯飼料營養(yǎng)成分含量Table 2 Nutrition composition of silage in each treatment

2.2 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯青貯品質(zhì)的影響

由表3可知，與對照組相比，處理Ⅰ組、處理Ⅱ組、處理Ⅲ組和處理Ⅳ組pH值都顯著降低(P<0.05)，且所有處理組都小于4.2，符合優(yōu)良青貯的要求；與對照組相比，各處理組的LA含量顯著增加(P<0.05)、AA含量和氨態(tài)氮/總氮比值顯著降低(P<0.05)；對照組和各處理組間的PA含量無顯著差異；對照組和各處理組在發(fā)酵過程中均未檢測到BA；各處理組V-Score評分都在90分(良好水平)以上，高于對照組。

表3 各處理青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)比較Table 3 Comparison of fermentation quality of ramie silage in different treatments

2.3 添加10%黑曲霉菌液進(jìn)行苧麻混合青貯不同時(shí)間酶活性的變化

對添加10%黑曲霉菌液的苧麻混合青貯0 d，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，15 d，30 d錳過氧化物酶(MnP)、漆酶、羧甲基纖維素酶(CMC)和木聚糖酶4種酶的活性進(jìn)行檢測。由圖1中A～D可知，MnP活性在0 d為344.24 u·L-1，在發(fā)酵前7 d持續(xù)下降，且下降幅度較大，第7 d比初始酶活下降了78.90%，15 d以后MnP活性基本維持穩(wěn)定狀態(tài)，第30 d MnP活性為24.23 u·L-1，比初始值下降了92.96%；漆酶活性在第0 d為26.04 u·mL-1，第1 d比初始值升高了162.29%，第1 d以后酶活開始下降，第7 d比第1 d酶活下降了78.95%，第7 d比初始值下降了44.78%，15 d以后下降速度大幅減緩，第30 d漆酶活性為14.31 u·mL-1，比初始值下降了45.04%；木聚糖酶在第0 d為 19.42 u·mL-1，發(fā)酵第1 d比初始酶活小幅上升了11.12%，第1 d以后開始下降，第7 d比初始酶活下降了54.43%，15 d以后木聚糖酶下降速度減緩，第30 d木聚糖酶活酶活為3.39 u·mL-1，比初始值下降了82.54%；CMC活性在0 d為98.48 u·mL-1，發(fā)酵前7天持續(xù)下降，且下降幅度較大，第7 d比初始酶活下降了76.72%，15 d以后CMC活性持續(xù)下降，但下降幅度減緩，第30 dCMC活性為8.31 u·mL-1，比初始值下降了91.56%。

圖1 不同發(fā)酵天數(shù)苧麻青貯中酶活性差異Fig.1 Differences in enzyme activities in castor silage under different fermentation days

3 討論

3.1 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯營養(yǎng)成分影響

黑曲霉在有氧發(fā)酵過程中可產(chǎn)生豐富的胞外酶，本試驗(yàn)檢測到的有CMC，MnP、漆酶和木聚糖酶(半纖維素酶)。纖維素酶和木聚糖酶(半纖維素酶)有降解NDF和ADF的作用，可以把植物細(xì)胞壁的纖維素分解為單糖和雙糖[18]；MnP、漆酶等是主要的木質(zhì)素降解酶[19]。張雪蕾等[20]通過添加纖維素酶進(jìn)行苧麻青貯，發(fā)現(xiàn)隨著纖維素酶添加水平的增加，苧麻青貯中的NDF和ADF呈下降趨勢。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，添加了黑曲霉的各處理組WSC含量顯著升高，NDF，ADF和ADL含量不同程度降低，并且處理Ⅱ組、處理Ⅲ組、處理Ⅳ組明顯優(yōu)于處理Ⅰ組對NDF，ADF和ADL的降解效果，可能是由于處理Ⅰ組中胞外酶的總量較少，所以降解效果較差。處理Ⅱ組、處理Ⅲ組和處理Ⅳ組NDF，ADF和ADL的降解效果無明顯差異，推測是因?yàn)楹谇咕禾砑恿砍?0%以后，各種酶的降解作用已發(fā)揮到極限，黑曲霉菌液的添加量與NDF，ADF和ADL的降解效果無正相關(guān)性。

3.2 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

目前，青貯主要是添加乳酸菌作為發(fā)酵促進(jìn)劑，在厭氧環(huán)境中通過乳酸菌的繁殖產(chǎn)生酸性環(huán)境，使青飼料得以長久保存。我們通過多次預(yù)試驗(yàn)證明，在不添加乳酸菌情況下，苧麻青貯仍可在短期內(nèi)形成酸性環(huán)境，且各組的pH均在4.2以下，符合優(yōu)質(zhì)青貯飼料的要求[21]，推測苧麻本身帶有豐富的乳酸菌。處理組pH值顯著低于對照組，可能是黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶和木聚糖酶等能將植物細(xì)胞壁的纖維素分解為乳酸菌繁殖提供所需營養(yǎng)，從而提高了LA的含量使pH值降低。任付平等[7]利用微生物對玉米進(jìn)行青貯，發(fā)現(xiàn)黑曲霉等微生物將玉米中的纖維降解為寡糖和單糖，為菌體生長提供豐富的營養(yǎng)環(huán)境，從而提高了LA的含量。魏曉斌等[22]通過添加乳酸菌和纖維素酶對苜蓿進(jìn)行青貯，發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌和纖維素酶可以彌補(bǔ)苜蓿原料乳酸菌與可溶性糖不足，顯著提高LA含量，顯著降低AA含量。李順等[23]通過添加糖蜜和纖維素酶對籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)進(jìn)行混合青貯，能極顯著降低籽粒莧與麥麩混合青貯的NH3-N/TN值。本試驗(yàn)中，我們通過添加黑曲霉及菌液補(bǔ)充了復(fù)合酶，與對照組相比，各處理組提高了LA含量、降低了AA含量；與對照組相比，處理組因添加黑曲霉及菌液在復(fù)合酶的作用下NH3-N/TN值顯著降低，與前人的研究結(jié)果一致。

3.3 添加黑曲霉菌液進(jìn)行苧麻青貯對不同時(shí)間酶活性的影響

黑曲霉為好氧菌，青貯發(fā)酵早期大量繁殖，產(chǎn)生大量分解底物的酶類物質(zhì)，迅速消耗原料中的氧氣，使青貯飼料進(jìn)入無氧狀態(tài)，菌體的活動(dòng)還可以提高青貯料的溫度，從而抑制其它好氧腐敗菌在青貯料中的生長繁殖[6]。在本研究中，漆酶和木聚糖酶在發(fā)酵第一天有不同程度的上升，說明黑曲霉在發(fā)酵初期利用了青貯袋中殘留的氧氣進(jìn)行了有氧發(fā)酵產(chǎn)生了胞外酶。左颯颯等[24]利用白腐菌進(jìn)行玉米秸稈的降解，在有氧條件下進(jìn)行發(fā)酵，木質(zhì)素及纖維素酶都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而升高。本研究在發(fā)酵初期也因少量氧氣存在，漆酶和木聚糖酶有酶活升高的現(xiàn)象，而后隨著時(shí)間的延長持續(xù)下降；CMC，MnP活性在發(fā)酵過程中持續(xù)下降。黑曲霉為好氧菌，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，氧氣被耗盡，無法進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生胞外酶，故酶活力逐步降低[25]。但4種酶在發(fā)酵30 d時(shí)仍有少量存在，對混合青貯的木質(zhì)纖維素降解起到了關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論

通過添加黑曲霉菌液對飼用苧麻進(jìn)行青貯，不同程度降低了混合青貯中的NDF，ADF和ADL，提高了苧麻青貯的發(fā)酵品質(zhì)。降解效果以處理組Ⅱ(即每千克混合青貯中添加100 mL黑曲霉菌液+100 mL無菌水)為最佳。黑曲霉在青貯前期短暫時(shí)間內(nèi)有氧條件下使漆酶和木聚糖酶酶活有所上升，后期各酶酶活持續(xù)下降，15 d后下降幅度趨緩慢。黑曲霉是苧麻進(jìn)行青貯發(fā)酵的優(yōu)良促進(jìn)劑，可提高發(fā)酵飼料品質(zhì)。