張建勇，王偉偉，崔宏春，薛金金，江和源

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江杭州310008；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院茶葉研究所，浙江杭州310024）

兒茶素、沒食子酸、咖啡堿等茶功能成分具有多種生物活性和藥理功效[1]，包括抗氧化[2]，抗癌[3-4]，抗炎[5-6]，降脂減肥[7-8]，降低膽固醇[9]，降血糖[10]等，在普通食品、保健食品、醫(yī)藥、日化用品、功能飼料等均有應(yīng)用，開發(fā)前景非常廣闊。兒茶素是茶多酚中含量相對較高、 生物活性較強的化學(xué)物質(zhì)，分為酯型兒茶素和非酯型兒茶素兩類，酯型兒茶素包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）等，非酯型兒茶素包括表兒茶素 （EC）、 表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、沒食子兒茶素（GC）等[11]。兒茶素具有多個酚羥基的分子結(jié)構(gòu)， 在貯藏和應(yīng)用的過程中，易受到溫度[12-13]、酸堿[14-15]、空氣[16]、濕度[17]、金屬離子[18-19]等因素影響，發(fā)生降解[20]、氧化聚合[21-22]、異構(gòu)化[23]、脫沒食子?；鵞24]等反應(yīng)，從而改變其原有的物化性質(zhì)、風(fēng)味品質(zhì)、生物活性。不同類型的酯型兒茶素和非酯型兒茶素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同[25]，決定了其穩(wěn)定性、氧化還原特性、水解特性、異構(gòu)特性等均存在較大差異。因此，如何保持其穩(wěn)定性非常關(guān)鍵， 相關(guān)的穩(wěn)態(tài)化技術(shù)研究是茶學(xué)領(lǐng)域熱點研究問題之一。

沒食子酸（Gallic acid，GA）是茶葉中可水解多酚類物質(zhì)的組成部分， 在云南普洱茶中的含量相對較高[26]，不僅與茶葉品質(zhì)呈正相關(guān)，而且具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗突變等多種生物活性[27]?？Х葔A（Caffeine）最早是在咖啡中被發(fā)現(xiàn)，但茶葉中的咖啡堿含量比咖啡中的含量高， 咖啡中咖啡堿的含量為1%～2%左右，而茶葉中咖啡堿的含量為2%～5%左右， 約占茶葉生物堿總量的95%以上。咖啡堿不僅是茶葉風(fēng)味品質(zhì)特征成分之一， 而且具有強心、利尿、興奮中樞神經(jīng)等作用[11]。有關(guān)沒食子酸和咖啡堿在不同溫度條件下的穩(wěn)定性文獻報道相對較少。

溫度是影響兒茶素、沒食子酸、咖啡堿貯藏穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素， 對其在終端應(yīng)用體系的物化特性、 風(fēng)味品質(zhì)、 生物活性保持具有非常重要的影響。30 ℃是發(fā)酵類茶食品、茶酒的發(fā)酵溫度，而且也是紅茶發(fā)酵工序葉溫重要參數(shù)， 溫度過高則發(fā)酵變化過分激烈、香低味淡、色暗，溫度過低則發(fā)酵時間延長、內(nèi)質(zhì)轉(zhuǎn)化不充分、風(fēng)味寡淡。60 ℃不僅是普洱茶殺青工藝的控制溫度， 而且也是茶點心、茶面包等熱加工茶食品貯存的底限溫度。文章以-18 ℃冷凍保存為對照， 探索了30 ℃、60 ℃溫度條件下茶兒茶素、 沒食子酸和咖啡堿的變化規(guī)律，分析溫度對酯型兒茶素、非酯型兒茶素、沒食子酸和咖啡堿的影響， 以期為茶產(chǎn)品貯藏保鮮和穩(wěn)態(tài)化利用研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

98%茶多酚 （無錫太陽綠寶科技有限公司），GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG 等 兒 茶 素標(biāo)準(zhǔn)品（美國SIGMA 公司），沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國SIGMA 公司），咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（美國SIGMA 公司），乙酸（國藥集團），乙腈、甲醇色譜純試劑（美國MERCK 公司）為色譜純試劑。

Waters 600-717-2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），KQ-100E 型超聲波脫氣機（江蘇昆山市超聲儀器有限公司），MR3001 型磁力攪拌器 （德國Heidoph 公司），5810R 型離心機 （德國Eppendorf 公司），DHG-9123A 型電熱恒溫箱 （上海精宏實驗設(shè)備有限公司），BCD-528WDPF 冰箱（海爾公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 貯藏穩(wěn)定性設(shè)計

稱取0.5 g 的98%茶多酚樣品，放入2 mL 帶蓋圓底塑料管內(nèi)，加蓋密封貯藏，然后分別放置在溫度為30 ℃、60 ℃的恒溫箱中， 以-18 ℃冰箱貯藏為對照，每隔7 天取樣，連續(xù)70 天取樣，取樣后的塑料管不再放回；分別配制1.0 mg/mL 水溶液，HPLC 檢測不同取樣點的酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）、非酯型兒茶素（EGC、GC、EC、C）、沒食子酸和咖啡堿的含量。

1.2.2 茶兒茶素、沒食子酸和咖啡堿HPLC 檢測方法

色譜柱Hypersil BDS C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相A 為2%乙酸，流動相B 為100%乙腈，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，進樣量5 μL，梯度洗脫，流動相B 在12 min內(nèi)由6.5%線性梯度變化到8%，16 min 變化到15%，20 min 變化到25%，30 min 回到初始狀態(tài)，平衡5 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)三次，采用Minitab 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件，進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對酯型兒茶素貯藏穩(wěn)定性的影響

通常情況下，茶多酚、兒茶素類物質(zhì)適宜低溫貯藏。文章以-18 ℃冷凍保存為對照， 考察了30 ℃、60 ℃條件下酯型兒茶素含量變化情況。由圖1 可以看出，-18 ℃冷凍保存條件下的EGCG和GCG 含量沒有變化。與-18 ℃對照相比，30 ℃和60 ℃條件下隨貯藏時間延長，EGCG 含量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，30 ℃條件EGCG 含量與對照無顯著性差異，60 ℃條件下EGCG 含量顯著低于對照，60 ℃條件下的EGCG 含量下降幅度明顯大于30 ℃條件下。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長GCG 含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，而60 ℃條件下隨貯藏時間延長GCG 含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢， 但均與對照無顯著性差異；EGCG含量變化幅度大于GCG 含量變化幅度，說明GCG熱穩(wěn)定性大于EGCG。吳平[28]研究表明，EGCG 在熱處理條件下，可能發(fā)生差向異構(gòu)化反應(yīng)、脫沒食子酸化反應(yīng)、 降解反應(yīng)以及有氧條件下的氧化聚合反應(yīng)。結(jié)合30 ℃、60 ℃貯藏條件下EGCG 和GCG 含量變化規(guī)律， 可以推測，30 ℃條件下，EGCG 和GCG 穩(wěn)定性較好，但是在60 ℃條件下，EGCG 穩(wěn)定性顯著降低， 部分EGCG 發(fā)生了差向異構(gòu)作用形成GCG， 導(dǎo)致了EGCG 含量快速下降， 而GCG 含量不降反增， 即60 ℃條件下以EGCG 向GCG 轉(zhuǎn)化的差向異構(gòu)作用為主。

圖1 不同溫度貯藏條件下EGCG 和GCG 含量變化的動力學(xué)曲線Fig. 1 Kinetic curves of EGCG and GCG contents at different storage temperatures

由圖2 可以看出，-18 ℃冷凍保存條件下的ECG 和CG 含量沒有變化。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長ECG 含量變化較小，與對照無顯著性差異， 穩(wěn)定性較好，60 ℃條件下的ECG 含量下降幅度較大，穩(wěn)定性較差。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長CG 含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，而60 ℃條件下隨貯藏時間延長CG 含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢， 但均與對照無顯著性差異；ECG 含量變化幅度大于CG 含量變化幅度，說明CG 熱穩(wěn)定性大于ECG。結(jié)合30℃、60 ℃貯藏條件下ECG 和CG 含量變化規(guī)律，可以推測，30 ℃條件下，ECG 和CG 穩(wěn)定性較好，但是在60 ℃條件下，ECG 穩(wěn)定性顯著降低， 部分ECG 發(fā)生了差向異構(gòu)作用形成CG， 導(dǎo)致了ECG含量快速下降，而CG 含量不降反增，即60 ℃條件下以ECG 向CG 轉(zhuǎn)化的差向異構(gòu)作用為主。

2.2 溫度對非酯型兒茶素貯藏穩(wěn)定性的影響

兒茶素在相對較高的溫度條件下易發(fā)生異構(gòu)化和自動氧化作用[29]。由圖3 的不同溫度貯藏條件下EGC 和GC 含量變化的動力學(xué)曲線可以看出，-18 ℃冷凍保存條件下的EGC 和GC 含量沒有變化。與-18 ℃對照相比，30 ℃和60 ℃條件下隨貯藏時間延長，EGC 含量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，30 ℃條件下EGC 含量與對照呈顯著性差異，60 ℃條件下EGC 含量與對照呈極顯著差異，60 ℃條件下的EGC 含量下降幅度明顯大于30 ℃條件下。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長GC 含量基本不變，而60 ℃條件下隨貯藏時間延長GC 含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢， 但均與對照無顯著性差異；EGC 含量變化幅度大于GC 含量變化幅度，說明GC 熱穩(wěn)定性大于EGC。結(jié)合30 ℃、60 ℃貯藏條件下EGC 和GC 含量變化規(guī)律，可以推測，30 ℃條件下，EGC 降解或氧化聚合是其穩(wěn)定性下降的主要作用，而GC 熱穩(wěn)定性較好；60 ℃條件下，部分EGC 發(fā)生了差向異構(gòu)作用形成GC，導(dǎo)致了EGC 含量快速下降；GCG 脫沒食子?；矔兂蒅C， 但是由于GCG 在60 ℃下幾乎沒減少，而60 ℃條件下GC 含量不降反增，推測GC 增加的主要原因是EGC 差向異構(gòu)化作用， 即60 ℃條件下以EGC 向GC 轉(zhuǎn)化的差向異構(gòu)作用為主。

圖2 不同溫度貯藏條件下ECG 和CG 含量變化的動力學(xué)曲線Fig. 2 Kinetic curves of changes in ECG and CG contents at different storage temperatures

圖3 不同溫度貯藏條件下EGC 和GC 含量變化的動力學(xué)曲線Fig. 3 Kinetic curves of EGC and GC contents at different storage temperatures

由圖4 的不同溫度貯藏條件下EC 和C 含量變化的動力學(xué)曲線可以看出，-18 ℃冷凍保存條件下的EC 和C 含量沒有變化。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長EC 含量基本不變，與對照無顯著性差異，而60 ℃條件下隨貯藏時間延長EC 含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢， 與對照呈顯著性差異。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長C 含量逐漸下降，而60 ℃條件下隨貯藏時間延長C 含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢， 但均與對照無顯著性差異。EC 含量變化幅度大于C 含量變化幅度， 說明C 熱穩(wěn)定性大于EC。結(jié)合30℃、60 ℃貯藏條件下EC 和C 含量變化規(guī)律，可以推測，30 ℃條件下，EC 和C 穩(wěn)定性較好， 但是在60 ℃條件下，EC 穩(wěn)定性顯著降低， 部分EC 發(fā)生了差向異構(gòu)作用形成C， 導(dǎo)致了EC 含量快速下降。CG 脫沒食子酸也會變成C， 但是由于CG 在60℃下幾乎沒減少，而60 ℃條件下C 含量不降反增， 推測C 增加的主要原因是EC 差向異構(gòu)化作用，即60 ℃條件下以EC 向C 轉(zhuǎn)化的差向異構(gòu)作用為主。

圖4 不同溫度貯藏條件下EC 和C 含量變化的動力學(xué)曲線Fig. 4 Kinetic curves of EC and C contents at different storage temperatures

2.3 溫度對沒食子酸貯藏穩(wěn)定性的影響

由圖5 的不同溫度貯藏條件下沒食子酸含量變化的動力學(xué)曲線可以看出，-18 ℃冷凍保存條件下的沒食子酸含量沒有變化。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長沒食子酸含量略有降低，而60 ℃條件下隨貯藏時間延長沒食子酸含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢， 但是30 ℃和60 ℃的沒食子酸含量與對照相比均無顯著性差異， 即沒食子酸在30 ℃和60 ℃溫度條件下穩(wěn)定性均較好。酯型兒茶素EGCG、GCG、ECG、CG 在一定溫度條件下，可發(fā)生脫沒食子?；饔谩＝Y(jié)合圖1、圖2 和圖5 結(jié)果， 推測60 ℃條件下酯型兒茶素EGCG、GCG、ECG、CG 在發(fā)生差向異構(gòu)作用、降解或氧化聚合的同時，也發(fā)生了脫沒食子?；磻?yīng)，進而出現(xiàn)圖5 的60 ℃條件下沒食子酸含量隨貯藏時間延長不降反升的現(xiàn)象。比較而言，沒食子酸在3個溫度條件下的穩(wěn)定性要大于酯型兒茶素、非酯型兒茶素。

圖5 不同溫度貯藏條件下沒食子酸含量變化的動力學(xué)曲線Fig. 5 Kinetic curves of gallic acid content at different storage temperatures

2.4 溫度對咖啡堿貯藏穩(wěn)定性的影響

由圖6 的不同溫度貯藏條件下咖啡堿含量變化的動力學(xué)曲線可以看出，-18 ℃冷凍保存條件下的咖啡堿含量沒有變化。與-18 ℃對照相比，30 ℃條件下隨貯藏時間延長咖啡堿含量基本沒有變化，而60 ℃條件下隨貯藏時間延長咖啡堿含量呈現(xiàn)略微下降的趨勢， 但是30 ℃和60 ℃的咖啡堿含量與對照相比均無顯著性差異， 即咖啡堿在30 ℃和60 ℃溫度條件下穩(wěn)定性均較好。將圖1、圖2、圖3、圖4 的兒茶素含量變化的動力學(xué)曲線，以及圖5 的沒食子酸含量變化的動力學(xué)曲線，與圖6 的咖啡堿含量變化動力學(xué)曲線比較， 可以看出，在-18 ℃、30 ℃、60 ℃貯藏條件下，咖啡堿的穩(wěn)定性要大于酯型兒茶素、非酯型兒茶素。

圖6 不同溫度貯藏條件下咖啡堿含量變化的動力學(xué)曲線Fig. 6 kinetic curve of caffeine content under different storage temperature

3 討論

兒茶素分子結(jié)構(gòu)的固有化學(xué)特性， 決定了其在外界環(huán)境改變的情況下， 不僅僅會發(fā)生差向異構(gòu)化作用，而且會發(fā)生氧化聚合、分解、水解、脫沒食子?；榷喾N作用， 這些作用之間可能存在競爭或協(xié)同作用，在某些特定的條件下，可能有幾種作用同時產(chǎn)生。SANG 等[30]、YOSHIHIRO 等[31]研究了茶湯溶液中兒茶素類物質(zhì)的穩(wěn)定性， 結(jié)果表明，82 ℃有利于兒茶素發(fā)生降解和異構(gòu)化。RYOTA 等[32]研究表明，溫度較低條件下茶湯中兒茶素主要發(fā)生降解反應(yīng)，溫度超過80 ℃時茶湯兒茶素主要發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)。WANG 等[33]采用不同溫度水浸提茶葉時發(fā)現(xiàn)，即使在低溫下浸提，茶湯中也有明顯的異構(gòu)化反應(yīng)， 與此同時， 其他的降解、氧化和聚合等反應(yīng)也同時存在。目前較多研究集中于茶葉功能成分在不同溫度溶液中的穩(wěn)定性，較少關(guān)注固體粉末不同溫度條件下的穩(wěn)定性。

文章研究了不同溫度條件下固體茶葉提取物中茶兒茶素、沒食子酸和咖啡堿的變化規(guī)律，結(jié)果表明， 在30 ℃條件下，EGC 以降解或氧化作用為主， 其它兒茶素相對穩(wěn)定性較好；60 ℃貯藏條件下，酯型兒茶素和非酯型兒茶素以差向異構(gòu)作用、脫沒食子?；饔脼橹?；GCG 熱穩(wěn)定性大于EGCG，CG 熱穩(wěn)定性大于ECG，C 熱穩(wěn)定性大于EC，GC 熱穩(wěn)定性大于EGC；沒食子酸、咖啡堿的穩(wěn)定性要大于酯型兒茶素、 非酯型兒茶素。文章以-18 ℃冷凍保存為對照， 考察了30 ℃、60 ℃溫度條件下兒茶素、沒食子酸和咖啡堿的穩(wěn)定性，可為兒茶素、 沒食子酸和咖啡堿等功能成分在食品中的穩(wěn)態(tài)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。有關(guān)不同溫度條件下兒茶素的差向異構(gòu)化、氧化聚合、降解、脫沒食子酰基等多種作用的競爭或協(xié)同關(guān)系， 以及兒茶素、沒食子酸、咖啡堿在食品、飲料、日化用品等不同體系的穩(wěn)態(tài)化應(yīng)用特性仍有待進一步研究。