飼料中沙門氏菌檢測技術(shù)的研究

王懷超

（濮陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南濮陽457000）

在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中，飼料內(nèi)沙門氏菌的存在是嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)主要因素，同時(shí)影響著社會(huì)公共安全。不同的沙門氏菌檢測技術(shù)各有優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)，應(yīng)用范疇方面也存在一定差異，只有全面了解這些差異，才能夠靈活、正確地采取相應(yīng)的檢測技術(shù)，最大限度地控制飼料中沙門氏菌的污染問題。筆者對沙門氏菌進(jìn)行了簡單的介紹，重點(diǎn)分析了檢測飼料沙門氏菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)，以供同行參考。

1 沙門氏菌概述

沙門氏菌以人畜共感染為主要特點(diǎn)，是無莢膜、無芽孢的一種病原菌。從沙門氏菌目前的研究進(jìn)展來看，已有超過2 000余種沙門氏菌血清型被公布了出來，我國在這方面的工作有很大的貢獻(xiàn)和突破，檢出300余種不同的沙門氏菌血清型，其中包括10多種國際新型沙門氏菌血清型。飼料一旦被沙門氏菌所污染，則可能傳播給人類或者動(dòng)物，需嚴(yán)格落實(shí)針對性的控制措施，重視飼料沙門氏菌的檢測工作，才能夠避免飼料內(nèi)出現(xiàn)沙門氏菌，消除飼料產(chǎn)品安全隱患。

2 檢測飼料中沙門氏菌的關(guān)鍵技術(shù)

2.1 沙門氏菌培養(yǎng)技術(shù)

在檢測飼料中沙門氏菌時(shí)，必須嚴(yán)格按照國際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行，先進(jìn)行沙門氏菌的培養(yǎng)。常見的培養(yǎng)技術(shù)以常規(guī)微生物學(xué)為基礎(chǔ)，通過按以下程序進(jìn)行。

第一步，液體培養(yǎng)基內(nèi)的檢測樣品需先開展預(yù)增菌操作，修復(fù)其中活性較差的沙門氏菌。

第二步，開展分離純化和選擇性增菌的操作，在兩個(gè)不同選擇性增菌液中分別轉(zhuǎn)接預(yù)增菌，開始培養(yǎng)，完成培養(yǎng)后再次分離純化，通過兩種不同選擇性瓊脂平板開展，鑒定已經(jīng)純化好的沙門氏菌疑似菌落。

此過程的鑒定可以通過微生物生化鑒定系統(tǒng)或者商品化生化鑒定專門試劑盒完成。

第三步，采取血清學(xué)鑒定方法處理分離好且純化完成的沙門氏菌疑似菌落，對自凝現(xiàn)象進(jìn)行排查，針對沒有自凝的疑似菌落開展Ⅵ抗原、H抗原、O抗原的檢測。

這種傳統(tǒng)且常見的沙門氏菌培養(yǎng)檢測技術(shù)，優(yōu)勢在于無假陽性、準(zhǔn)確性高，缺點(diǎn)在于耗時(shí)較長，操作程序繁瑣，通常整個(gè)檢測周期在6 d左右。

2.2 主要分子生物學(xué)檢測技術(shù)

目前檢測飼料中沙門氏菌的分子生物學(xué)檢測方法主要包括以下幾種。

2.2.1 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測法

熒光定量PCR技術(shù)目前廣泛應(yīng)用，發(fā)展速度較快，是深受歡迎的沙門氏菌快速檢測技術(shù)之一，解決了傳統(tǒng)PCR檢測過程污染概率大的問題，彌補(bǔ)了假陽性結(jié)果出現(xiàn)頻率高的不足，體現(xiàn)出了可定量、重復(fù)性高、特異性強(qiáng)、靈敏度強(qiáng)等技術(shù)優(yōu)勢。在具體檢測中多樣品的細(xì)菌定量和擴(kuò)增可以同時(shí)完成，常見于大批飼料樣品的沙門氏菌檢測工作，在檢測傳染病和食源性病原菌方面的作用非常大。

2.2.2 基因芯片檢測法

在飼料沙門氏菌檢測技術(shù)中，基因芯片檢測法是一種常見的快速檢測方法，利用沙門氏菌毒力因子、抗原和其致病性之間的關(guān)系，對腸道內(nèi)沙門氏菌通過基因芯片進(jìn)行快速檢測，進(jìn)而完成鑒定未知菌屬的工作。

2.2.3 核酸探針檢測法

核酸探針檢測法已經(jīng)融入了DNA-RNA雜交檢測技術(shù)，克服了傳統(tǒng)的鼠傷寒沙門氏菌檢測技術(shù)難題，適用于飼料食品的沙門氏菌檢測，探針具有更高的敏感性，通過48 h左右的增菌處理后，在專門實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成檢測操作。但因?qū)z測條件要求較高，所以實(shí)際推廣和應(yīng)用受到一定阻礙。從該技術(shù)研究現(xiàn)狀來看，以核酸探針為基礎(chǔ)的沙門氏菌比色劑檢測技術(shù)正在迅速興起，保持了檢測的高敏感性，同時(shí)讓無輻射檢測從不可能變?yōu)榱擞锌赡堋?/p>

2.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測法的核酸擴(kuò)增技術(shù)較為新穎、高效，優(yōu)點(diǎn)在于控制效率高和特異性較強(qiáng)，60～65℃環(huán)境下能在60 min內(nèi)完成擴(kuò)增，形成白色沉淀副產(chǎn)物，能利用沉淀濁度進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的判斷。

2.3 主要免疫學(xué)檢測技術(shù)

目前飼料中沙門氏菌的免疫學(xué)檢測方法主要包括以下幾種。

2.3.1 免疫膠體金檢測法

對樣品抗原采取雙抗夾心技術(shù)進(jìn)行有效檢測，載體為硝酸纖維素膜，原理在于微孔膜具有毛細(xì)血管功能。在被檢飼料樣品內(nèi)浸入試紙下端，在毛細(xì)管作用下的樣品會(huì)向金標(biāo)抗體墊過濾并進(jìn)入，相應(yīng)抗原與金標(biāo)抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，逐漸滲移向膜條，不會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，所以檢測試紙沒有紅色反應(yīng)。這種檢測技術(shù)常見于環(huán)境、飼料、食品中沙門氏菌的檢測，具有較高準(zhǔn)確性、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是需要較高檢測成本。

2.3.2 特異性抗體介入檢測法

應(yīng)用特異性抗體介入檢測技術(shù)進(jìn)行沙門氏菌檢測時(shí)，需先在選擇性增菌液內(nèi)添加多克隆抗體，對干擾菌發(fā)揮出生長抑制作用，防止干擾后期的選擇性分離。相較于一些常規(guī)檢測方法而言，特異性抗體介入檢測技術(shù)減少了沙門氏菌假陽性結(jié)果的概率，不過也有技術(shù)缺點(diǎn)，主要體現(xiàn)在準(zhǔn)確性不足、制備繁瑣等方面。

2.3.3 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測法

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測法的固相載體為硝酸纖維素膜，反應(yīng)發(fā)生在膜上，抗體或抗原含量的判斷依據(jù)膜片中央出現(xiàn)的斑點(diǎn)深淺程度進(jìn)行。斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測沙門氏菌方法的優(yōu)點(diǎn)在于能長期保存檢測結(jié)果、成本低、操作簡單，缺點(diǎn)在于產(chǎn)生假陽性結(jié)果概率較大、特異性較低。

2.3.4 乳膠凝集檢測法

乳膠凝集檢測法檢測沙門氏菌的方法屬于間接凝集檢測試驗(yàn)，惰性載體為聚苯乙烯膠乳微粒（人工合成），表面能對可溶性抗原進(jìn)行吸附，結(jié)合特異性抗體發(fā)生凝集現(xiàn)象。此技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于無須特殊儀器、操作簡單、可在基層現(xiàn)場進(jìn)行檢測，缺點(diǎn)在于假陰性結(jié)果概率較高、敏感性不足。