陳 永，楊蓮辭，常定發(fā)

（1.云南省瀘西縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 瀘西 652400；2.云南省瀘西縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 瀘西）

隨著動(dòng)物疫病檢測(cè)需求增加，PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室業(yè)務(wù)量有所加大。開展PCR檢測(cè)，很可能會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染，影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和效果，造成假陽性，同時(shí)也會(huì)給實(shí)驗(yàn)人員健康造成損害。

1 PCR實(shí)驗(yàn)室污染檢測(cè)評(píng)估

（1）因PCR檢測(cè)的樣品及其產(chǎn)物污染無色無味，主觀很難判斷，應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)、地板、設(shè)備、器具等采集棉拭子樣進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估是否存在污染。樣品要規(guī)范編號(hào)記錄，以便追溯。（2）查看實(shí)驗(yàn)室最近疑似污染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告，看陰性對(duì)照（水）Ct值（反應(yīng)管內(nèi)營(yíng)光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的值時(shí)所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)）。陰性對(duì)照（水）Ct＞38，輕微污染；35＜Ct＜38，中等污染；Ct＜35，嚴(yán)重污染。如只是陰性對(duì)照污染，樣品中仍有陰性，則可能是樣品交叉污染或操作不當(dāng)，通過規(guī)范仔細(xì)的重復(fù)操作以避免污染。如所有的曲線都呈陽性，而且陰性對(duì)照和許多標(biāo)本的線性相似，則考慮是系統(tǒng)污染，如檢測(cè)試劑污染或氣溶膠污染。（3）試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

2 污染的來源

2.1 陽性樣本或陽性樣本核酸的污染 此類污染多發(fā)生于樣品處理間，造成樣品間的污染。在采集的樣品中，如存在陽性樣品，在樣品的采集、放置、運(yùn)輸?shù)倪^程中，由于封裝不嚴(yán)溢出于容器外，導(dǎo)致污染容器、樣品的交叉污染等；實(shí)驗(yàn)過程中，移液器使用不當(dāng)，吸液時(shí)回槍手速過快導(dǎo)致的移液器槍頭部分被陽性樣本污染；樣品加熱裂解核酸后，立即打開儀器熱蓋，反應(yīng)管突然遇冷導(dǎo)致崩開，濺出核酸；核酸釋放后，未離心，管蓋上有液體，濺出導(dǎo)致的污染；吸取陽性對(duì)照的槍頭，處理不當(dāng)造成的污染；由于通風(fēng)不良，病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致交叉污染。

2.2 陽性對(duì)照的污染 在使用陽性對(duì)照時(shí)，未離心，導(dǎo)致陽性對(duì)照泄漏，造成的污染；吸取陽性對(duì)照的槍頭，處理不當(dāng)造成的污染。陽性對(duì)照的泄露易造成試劑的污染。

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染 擴(kuò)增過程中或擴(kuò)增結(jié)束后，PCR管蓋未蓋嚴(yán)或崩開導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物泄露，造成的污染。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，擴(kuò)增后的PCR管開蓋等動(dòng)作容易產(chǎn)生氣溶膠，極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽性。

3 防范污染的措施

進(jìn)行PCR檢測(cè)操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR檢測(cè)過程中的污染。

3.1 劃分操作區(qū) 實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，試劑配制、樣品處理和擴(kuò)增要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：（1）試劑準(zhǔn)備間：配置試劑、加陰性對(duì)照，要有單獨(dú)的一套移液槍、離心機(jī)、耗材，試劑配制應(yīng)在獨(dú)立的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域不做任何跟樣本相關(guān)的操作，嚴(yán)禁跟樣本相關(guān)的任何物品進(jìn)入。（2）樣本處理間：樣本處理、核酸提取、加樣本核酸、陽性對(duì)照等。要有單獨(dú)的一套移液槍、離心機(jī)、耗材等。樣本提取應(yīng)在獨(dú)立的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域主要處理樣品，嚴(yán)禁帶未消毒的設(shè)備進(jìn)入樣本處理間。（3）PCR擴(kuò)增區(qū)及分析間：放置PCR儀、電腦及打印機(jī)等設(shè)備。任何一間的器材獨(dú)立使用，不要拿到其他兩個(gè)工作間。

3.2 實(shí)驗(yàn)人員操作規(guī)范 （1）操作前佩戴好個(gè)人防護(hù)用品，用核酸祛除劑噴灑移液器、吸頭盒等，并放入生物安全柜中。（2）實(shí)驗(yàn)人員操作時(shí)要穿戴各區(qū)間的專用工作服、手套、口罩等，完成一項(xiàng)操作或發(fā)現(xiàn)污染及時(shí)更換手套。實(shí)驗(yàn)完成離開實(shí)驗(yàn)室，更換工作服，脫掉手套、口罩等，嚴(yán)禁將工作服穿出實(shí)驗(yàn)室外。（3）對(duì)一些活毒樣品在提取前，應(yīng)將樣品用60 ℃ 水浴滅活處理不少于30 min，防止活病毒造成污染和擴(kuò)散。（4）吸頭盒不用時(shí)保持關(guān)閉狀態(tài)，避免吸完樣品，特別是陽性對(duì)照的吸頭經(jīng)過時(shí)造成污染。（5）取樣、加液前，應(yīng)做瞬時(shí)離心，將管蓋、管壁上液體完全沉于管底。開蓋時(shí)動(dòng)作要輕緩，防止液體濺出。使用移液器時(shí)要注意快壓慢放或使用帶濾芯的吸頭，防止液體污染移液器管頭。（6）實(shí)驗(yàn)過程中最先加陰性對(duì)照，蓋好蓋子后再加待檢核酸，最后加陽性對(duì)照。用后的廢吸頭、其它廢棄物品、污染物等集中放入裝有10 % 84消毒液的廢液缸內(nèi)，消毒液要能完全浸泡廢棄物品。（7）PCR擴(kuò)增完成后，如無必要，盡量不要打開或少打開反應(yīng)體系，如必須打開，應(yīng)在獨(dú)立專用區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。

4 污染的處理

4.1 輕度污染的處理 PCR板、八聯(lián)管板、離心機(jī)轉(zhuǎn)子用50 % 84消毒液浸泡30 min，反復(fù)幾次。操作臺(tái)面先酒精擦拭，再用30 % 84消毒液反復(fù)擦拭幾次，每次實(shí)驗(yàn)前后都要用酒精對(duì)所有的操作臺(tái)面、移液槍、離心機(jī)進(jìn)行擦拭。地面用30 % 84消毒水進(jìn)行擦拭，1～2次/d。實(shí)驗(yàn)環(huán)境通風(fēng)、紫外線燈照射。經(jīng)過以上方法處理，污染基本可以1周左右消除。

4.2 中度和重度污染的處理 （1）評(píng)估污染源頭：評(píng)估是環(huán)境污染、器材污染（尤其是移液槍和離心機(jī)）還是試劑盒污染。①準(zhǔn)備一套新的移液槍、離心機(jī)、耗材、試劑盒。②用新的移液槍和原來試劑在新的環(huán)境配2個(gè)陰性對(duì)照上機(jī)擴(kuò)增，如果沒有污染，說明試劑盒沒有問題；如果有污染，說明試劑盒有污染。用新的移液槍和新的試劑盒在原來環(huán)境配2個(gè)陰性對(duì)照上機(jī)擴(kuò)增，如果沒有污染，說明環(huán)境沒有問題；如果有污染，說明環(huán)境有污染。用原來移液槍和新的試劑盒在新的環(huán)境配2個(gè)陰性對(duì)照上機(jī)擴(kuò)增，如果沒有污染，說明移液槍沒有問題；如果有污染，說明移液槍有污染。（2）不同污染的處理：①器材污染：移液器污染移液槍不帶槍頭吸酒精，并把槍柄部分浸泡在酒精中，目的是使有機(jī)物溶解。再用移液槍不帶槍頭吸清水，反復(fù)幾次，目的是把酒精及有機(jī)物清洗掉，之后用移液槍不帶槍頭吸50 % 84消毒水，反復(fù)幾次，并停留30 min，最后用移液槍不帶槍頭吸清水，反復(fù)幾次，目的是把84消毒水清洗掉。以上操作重復(fù)幾次，再用三把移液器不帶槍頭吸清水，把清水當(dāng)作樣品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估污染是否消除。離心板架或者八聯(lián)管板架污染，使用酒精浸泡后，再用清水清洗干凈，之后再用30 % 84消毒水浸泡30 min以上，最后再用清水清洗干凈，多重復(fù)幾次。離心機(jī)污染，使用酒精擦拭后，用清水反復(fù)擦拭，轉(zhuǎn)子用50 % 的84消毒液浸泡，再用清水洗干凈，晾曬干，再用棉簽取離心機(jī)拭子檢測(cè)，評(píng)估污染是否解除。②試劑盒污染，封存，用新的試劑盒實(shí)驗(yàn)。③環(huán)境污染，30 % 84消毒液擦拭操作臺(tái)面2～3次，次數(shù)可根據(jù)實(shí)際情況增減。設(shè)備門把手、門窗把手和外部區(qū)域10 % 84消毒液擦拭2～3次。所有垃圾能用消毒水浸泡的浸泡，不能浸泡的無害化處理。地面采用拖把沾50 % 84消毒液進(jìn)行反復(fù)拖地，1～2次/d。有紫外線的設(shè)備開啟紫外線燈照射30 min，房間內(nèi)進(jìn)行紫外線長(zhǎng)時(shí)間照射消毒，每天進(jìn)行 。環(huán)境保持通風(fēng)，降低氣溶膠的蓄積，如果通風(fēng)不暢的可采取風(fēng)扇機(jī)械通風(fēng)。處理后采集環(huán)境樣品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估污染是否消除。