潘維揚(yáng)，顧宗英，葛曉春

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

多聚ADP核糖化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，有兩類酶參與該修飾過程：一類是負(fù)責(zé)修飾的多聚ADP核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase,PARP)；另一類則是負(fù)責(zé)去修飾的多聚ADP核糖水解酶(poly(ADP-ribose) glycohydrolase,PARG)[1].PARP可被DNA損傷激活，然后以NAD+為底物，將ADP核糖基團(tuán)連接到靶蛋白的谷氨酸、賴氨酸或天冬氨酸殘基上，經(jīng)過多次催化，可以形成長(zhǎng)達(dá)幾百個(gè)ADP核糖基團(tuán)的長(zhǎng)鏈，即多聚ADP核糖(poly(ADP-ribose),PAR)鏈[2].依賴PAR鏈，PARP可募集多個(gè)互作蛋白，共同參與DNA的損傷修復(fù)；但PAR如果產(chǎn)生過量，則會(huì)過多消耗細(xì)胞內(nèi)的NAD+分子，導(dǎo)致細(xì)胞能量衰竭，從而激活程序性死亡途徑[3]，因此適量的PAR是DNA損傷修復(fù)信號(hào)，而過量的PAR則是細(xì)胞凋亡信號(hào)[4].PARG是PARP的逆反應(yīng)酶，負(fù)責(zé)將多聚ADP核糖從被修飾的蛋白質(zhì)上水解下來(lái)，使蛋白質(zhì)恢復(fù)到原來(lái)的狀態(tài)[1,5].

在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的可被多聚ADP核糖化修飾的底物包括：PARP本身、組蛋白、腫瘤抑制因子p53和DNA修復(fù)相關(guān)蛋白等[5]，這些被修飾的蛋白參與了DNA損傷響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄延伸、染色質(zhì)重塑和RNA剪接等過程[6].植物中發(fā)現(xiàn)被多聚ADP核糖化修飾的底物包括組蛋白H1、H2A和H2B[7-8]，但最主要的還是PARP1和PARP2自身[9]，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)與植物免疫相關(guān)的蛋白DAWDLE(DDL)也可被多聚ADP核糖化修飾[10].

擬南芥中有3個(gè)PARP基因(PARP1，PARP2，PARP3)和2個(gè)PARG基因(PARG1，PARG2)[11]，這3個(gè)PARP基因的功能有所分化，其中PARP1和PARP2具有多聚ADP核糖化修飾活性，與DNA損傷修復(fù)有關(guān)，PARP1和PARP2突變后植物對(duì)基因毒劑的耐受性下降[12]；PARP3沒有多聚ADP核糖化修飾活性，但它突變后種子的貯存壽命縮短，目前它參與的分子生物學(xué)過程尚不清楚[12-13].兩個(gè)PARG基因中，PARG1起主要作用，PARG1的突變體parg1-4對(duì)誘導(dǎo)DNA損傷的基因毒劑異常敏感，表現(xiàn)為葉原基及根尖生長(zhǎng)點(diǎn)處的細(xì)胞分裂嚴(yán)重受阻，真葉和根的生長(zhǎng)發(fā)育減慢，死亡細(xì)胞明顯增多，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在突變體的根及葉片中積累了大量的PAR；PARG2基因的突變體與野生型相比沒有明顯的表型，表明在DNA損傷的情況下，PARG1確實(shí)是負(fù)責(zé)體內(nèi)PAR降解的主要水解酶[14].

PARP1和PARP2除了受DNA損傷的誘導(dǎo)外，還受γ射線和活性氧的誘導(dǎo)[15]，擬南芥中PARP1和PARP2突變后，植株對(duì)干旱脅迫、強(qiáng)光脅迫和熱脅迫的耐受性增強(qiáng)，其表型與體內(nèi)PAR水平的降低有關(guān)[3]；PARP3只在種子中高量表達(dá)，在苗期表達(dá)水平很低，但強(qiáng)光、甲基紫精和高鹽也可以誘導(dǎo)苗期PARP3表達(dá)量升高[16]；擬南芥接種病原菌后體內(nèi)PAR水平顯著提升，PARP抑制劑3-AB可以抑制植物對(duì)病原菌中的MAMPs(Microbe-Associated Molecular Patterns)的免疫反應(yīng)[17].另外，在大豆培養(yǎng)細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)：過量表達(dá)AtPARP2在低ROS(Reactive Oxygen Species)濃度下對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，但在高ROS濃度下會(huì)加劇細(xì)胞死亡[18].PARP抑制劑有效地防止了氧化脅迫和熱脅迫誘導(dǎo)的大豆和煙草細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡[19].植物體內(nèi)PARP的激活盡管對(duì)DNA損傷修復(fù)有利，但在逆境下過度激活則會(huì)大量消耗能量物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡.因此，PAR的穩(wěn)態(tài)必須受到嚴(yán)格調(diào)控[20].

由于parg1突變體中PAR大量積累，且對(duì)基因毒劑異常敏感，為了進(jìn)一步闡明PARP家族中各個(gè)成員與parg1突變體表型之間的關(guān)系，本研究通過雜交獲得了擬南芥PARP2和PARG1的雙突變體parp2-3parg1-4(簡(jiǎn)稱p2g1)，通過表型觀察并結(jié)合分子生物學(xué)手段，分析了PARP2突變對(duì)parg1-4體內(nèi)PAR水平、DNA損傷響應(yīng)以及一些與調(diào)控細(xì)胞死亡有關(guān)的基因表達(dá)水平的影響，從而為了解PARP家族各個(gè)成員的體內(nèi)活性和功能提供了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長(zhǎng)條件

本文所用的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Columbia生態(tài)型(Col-0)，突變體均為T-DNA插入突變體，這些突變體的相關(guān)信息可參考已發(fā)表文章[12,14].擬南芥種植在營(yíng)養(yǎng)土(m黑土∶m蛭石∶m珍珠巖=9∶3∶1)中或1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為22℃，長(zhǎng)日照(16h光照/8h黑暗).

種子經(jīng)70%乙醇消毒10min后，再用100%乙醇洗滌，然后置于滅菌濾紙上晾干，用滅菌牙簽點(diǎn)種到1/2MS培養(yǎng)基上或直接撒于營(yíng)養(yǎng)土中，4℃低溫層積化2d后放入溫室或植物生長(zhǎng)箱中培養(yǎng).

對(duì)于需要用基因毒劑處理然后觀察表型的材料，則將種子直接播種在含有100μg/mL博來(lái)霉素(zeocin)或者含有60μg/mL甲基磺酸甲酯(MMS)的平板上，2周后拍照和測(cè)量生長(zhǎng)指標(biāo).

1.2 方法

1.2.1 植物總蛋白的提取

用液氮研磨擬南芥幼苗，加適量裂解液(5% 1mol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，1% 0.5mol/L MgCl2，10% 1mol/L NaCl，0.1% NP40，按1∶50加入蛋白酶抑制劑，1∶500加入1mmol/L DTT)，輕輕混勻后于冰上浸提5min，然后13000g，4℃離心10min取上清，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液于100℃金屬浴煮12min，再13000g室溫離心5min取上清.

1.2.2 Western blot

加蛋白樣品于SDS-PAGE膠中，恒壓120V電泳，根據(jù)目的條帶大小控制電泳時(shí)間.電泳結(jié)束后，用去離子水沖洗SDS-PAGE膠，然后恒流300mA轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂牛奶室溫封閉膜2h，再加入一抗室溫孵育1h，TBST(NaCl 8.8g/L，1mol/L Tris-HCl pH8.0 20mL/L，Tween-20500μL/L)洗膜3次，每次8min；二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次8min，最后用顯色試劑在顯色儀下顯色.所用抗體為：一抗為Anti-pan-ADP-ribose binding reagent(Millipore)和β-tubulin(Abiocode)；二抗為Goat Anti-Rabbit IgG，HRP Conjugated(康為世紀(jì))或者Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated(Abiocode).

1.2.3 植物雜交

選擇parp2-3未開放的花作為母本，用鑷子去除花萼、花瓣和雄蕊，留下柱頭，選擇parg1-4已經(jīng)完全開放的花作為父本，用鑷子取下雄蕊柄部，在母本柱頭上輕輕擦拭數(shù)次，做好標(biāo)記.2～3d后，如果柱頭伸長(zhǎng)，則表明雜交成功.

1.2.4 雙突變體的鑒定

選擇雜交F2代的單株植物葉片鑒定，先用CTAB法提取DNA，再利用表1中的引物進(jìn)行PARP2和PARG1基因鑒定，若基因型為野生型，則只有LP+RP能擴(kuò)增出條帶；若基因型為純合突變，則只有RP+LB能擴(kuò)增出條帶；若基因型為雜合子，則LP+RP和RP+LB都能擴(kuò)增出條帶.

表1 雙突變體鑒定引物序列Tab.1 Primers for identifying double mutants

1.2.5 葉綠素含量測(cè)定

先稱量擬南芥幼苗鮮重，接著用液氮研磨材料，再加提取液(V丙酮∶V無(wú)水乙醇=95∶5)提取葉綠素，9000g離心10min后取上清，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量A645和A663，根據(jù)下列公式計(jì)算葉綠素含量：

葉綠素濃度Ct=8.02A663+20.21A645，

葉綠素含量(mg/g)=(Ct×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮重

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在1/2 MS平板上生長(zhǎng)10d的Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1幼苗，分別用200μg/mL zeocin和MMS處理，并于0、6、12、24、48h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材.利用TRIzol試劑(TaKaRa)抽提苗的總RNA，然后用PrimeScript RT-PCR Kit with gDNA eraser試劑盒(TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR).目的基因相對(duì)Ubiquitin5(UBI)基因的表達(dá)量通過2-ΔΔCt公式進(jìn)行計(jì)算，所用引物序列見表2.

表2 定量PCR引物序列Tab.2 Primers for Quantitative Real-time PCR

檢測(cè)的DNA損傷響應(yīng)和細(xì)胞死亡有關(guān)基因如下：多聚ADP核糖化聚合酶1(poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1)基因，γ反應(yīng)抑制因子1(suppressor of gamma response 1,SOG1)基因，1型乳腺癌(breast cancer type 1,BRCA1)基因，精氨酸/賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1(metacaspase 1,MC1)基因和精氨酸/賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8(metacaspase 8,MC8)基因.

2 結(jié)果與分析

2.1 雙突變體p2g1在zeocin和MMS處理下的表型分析

PAR由PARP酶產(chǎn)生，為了解析PARP家族成員中的PARP2與parg1-4表型的關(guān)系，我們通過雜交構(gòu)建了parp2-3和parg1-4的雙突變體，簡(jiǎn)稱p2g1，觀察PARP2的突變是否可以恢復(fù)parg1-4的表型.zeocin可造成DNA雙鏈斷裂和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[21].正常條件下，Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1的生長(zhǎng)狀況基本相同，但在含100μg/mL zeocin的平板上，與Col-0相比，parp2-3葉片略黃，parg1-4植株小且葉片發(fā)黃，雙突變體p2g1并未呈現(xiàn)類似parg1-4的表型，而是更接近于單突變體parp2-3(圖1(a)和(b)).通過測(cè)定鮮重(圖1(c))，我們發(fā)現(xiàn)在zeocin處理下，只有parg1-4與Col-0相比有顯著性差異.通過葉綠素含量測(cè)定(圖1(d))發(fā)現(xiàn)：p2g1的葉綠素含量高于parg1-4，而接近于parp2-3.以上結(jié)果說明PARP2突變可以部分恢復(fù)parg1-4在zeocin處理下葉片發(fā)黃死亡的表型.我們又將Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1同時(shí)點(diǎn)種于1/2MS平板和含 60μg/mL MMS的平板上，MMS是一種烷化劑，主要造成DNA單鏈斷裂[22].經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在含60μg/mL MMS的平板上，各突變體的表型差異最大.正常條件下，Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1生長(zhǎng)2周后表型相似，但在60μg/mL MMS處理下，與Col-0相比，parp2-3表現(xiàn)敏感，根長(zhǎng)略短，parg1-4植株小且根長(zhǎng)極短，而雙突變體p2g1生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于parg1-4(圖2(a)和(b))，接近parp2-3.通過測(cè)定鮮重和根長(zhǎng)(圖2(c)和(d))，發(fā)現(xiàn)在MMS處理?xiàng)l件下，parg1-4與Col-0相比有極顯著性差異，p2g1表型介于parp2-3和parg1-4之間，說明PARP2突變可以部分恢復(fù)parg1-4對(duì)MMS敏感的表型，使得植物在MMS平板上生長(zhǎng)狀態(tài)更好.

2.2 parp2-3和parg1-4單/雙突變體中PAR的水平分析

利用zeocin和MMS分別處理Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1幼苗，于24h和48h取樣，通過Western blot檢測(cè)體內(nèi)的PAR水平(圖3，見第708頁(yè)).結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在沒有基因毒劑處理時(shí)，體內(nèi)檢測(cè)不到PAR信號(hào)；在基因毒劑處理下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，PAR水平呈升高趨勢(shì).

在zeocin處理下(圖3(a))，所有突變體中parg1-4的PAR信號(hào)最強(qiáng)，其他突變體中的PAR信號(hào)都遠(yuǎn)低于parg1-4；在parg1-4中，PAR信號(hào)從70kDa到接近膠孔位置都有分布，說明產(chǎn)生了巨大分子量的PAR鏈，而Col-0的PAR信號(hào)與parg1-4相比不僅弱，且分子量主要分布在130kDa到250kDa區(qū)間，parp2-3中的PAR信號(hào)比野生型弱，說明PARP2對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)PAR的產(chǎn)生有貢獻(xiàn)；雙突變體p2g1的PAR信號(hào)上升快，但也與Col-0一樣，未出現(xiàn)較多的長(zhǎng)PAR修飾鏈，總體來(lái)說，p2g1中的PAR信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于parg1-4，但強(qiáng)于parp2-3，現(xiàn)存的信號(hào)可能由PARP家族另外的成員，比如說PARP1產(chǎn)生.

在MMS處理下(圖3(b))，parg1-4中的PAR信號(hào)也比其他遺傳材料中的PAR信號(hào)強(qiáng)，鏈長(zhǎng)從低到高都有分布，但強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于zeocin處理后的信號(hào)強(qiáng)度，說明單鏈DNA損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生PAR的能力較雙鏈DNA損傷弱.24h時(shí)Col-0和parp2-3幾乎沒有PAR信號(hào)，而雙突變體p2g1中僅出現(xiàn)微弱的PAR信號(hào)，48h時(shí)雙突變體p2g1中的信號(hào)也遠(yuǎn)低于parg1-4，接近于parp2-3，說明p2g1較parg1-4降低的PAR信號(hào)主要是由PARP2貢獻(xiàn)的.

2.3 zeocin和MMS處理下單/雙突變體中DNA損傷與死亡響應(yīng)基因的表達(dá)水平比較

與parg1-4相比，p2g1雙突變體對(duì)基因毒劑敏感的表型得到了部分恢復(fù)，為了探究它的DNA損傷反應(yīng)和細(xì)胞死亡響應(yīng)是否也恢復(fù)到正常，我們選取了一些DNA損傷和細(xì)胞死亡響應(yīng)過程中的關(guān)鍵基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)它們的表達(dá)量(圖4).

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在zeocin處理下，從0h到6h，響應(yīng)DNA損傷的基因PARP1、SOG1和BRCA1的表達(dá)量在4種基因型的植物中都呈上升狀態(tài)，6h時(shí)在parg1-4中的表達(dá)量明顯高于其他3種基因型的植物，且到達(dá)表達(dá)高峰；從0h到12h，正調(diào)控細(xì)胞死亡的基因MC1在parg1-4中呈上升趨勢(shì)，12h后穩(wěn)定保持在較高的表達(dá)水平；48h時(shí)，正調(diào)控細(xì)胞死亡的基因MC8在parg1-4的表達(dá)量也明顯高于其他3種植物.在雙突變體p2g1中，這些基因表達(dá)的上升趨勢(shì)被抑制，DNA損傷響應(yīng)以及細(xì)胞死亡基因的表達(dá)水平均低于parg1-4，而更接近于parp2-3，與表型一致.

用MMS處理突變體發(fā)現(xiàn)，從0h到12h，響應(yīng)DNA損傷的基因PARP1、SOG1和BRCA1的表達(dá)量在4種基因型的植物中都呈上升狀態(tài)，在12h時(shí)表達(dá)均到達(dá)高峰，但是在parg1-4中，這些基因的表達(dá)水平均是最高的，表明parg1-4仍然是對(duì)MMS最敏感的基因型，在p2g1突變體中，這些基因的表達(dá)水平更接近于parp2-3，而明顯不同于parg1-4(圖5).相較于zeocin處理，在4種植物中，上述DNA損傷響應(yīng)基因表達(dá)峰值的到來(lái)均往后推遲了6h，這與MMS相對(duì)較弱的DNA損傷能力一致；從0h到48h，MC1和MC8在parg1-4中的表達(dá)呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，12h后明顯高于其他3種基因型的植物，而在其他3種材料中這兩個(gè)基因的表達(dá)量差別不大，且只有輕微的上調(diào).以上結(jié)果說明：在MMS誘導(dǎo)的單鏈DNA損傷的情況下，盡管DNA損傷響應(yīng)基因和細(xì)胞死亡標(biāo)志性基因的表達(dá)在parg1-4中被上調(diào)，但在p2g1雙突變體中，這種上調(diào)趨勢(shì)被阻止.

3 討 論

PARP可被斷裂DNA激活，進(jìn)行自我修飾后募集其他DNA損傷修復(fù)蛋白如XRCC1、KU70到損傷位點(diǎn)，一起參與DNA損傷修復(fù)[19].修復(fù)過程啟動(dòng)后，PAR被PARG很快降解，避免積累，但當(dāng)體內(nèi)DNA損傷持續(xù)存在或者修復(fù)受阻時(shí)，大量產(chǎn)生的PAR就成為了細(xì)胞凋亡的信號(hào)[4].研究表明：動(dòng)物中過量的PAR會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，與線粒體表面的凋亡誘導(dǎo)因子互作，促進(jìn)AIF(apoptosis-inducing factor)大量釋放，所以PAR大量積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]，因此，降解PAR的PARG在維持細(xì)胞內(nèi)多聚ADP核糖化水平中至關(guān)重要.研究表明，小鼠中PARG敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎致死[23]，果蠅中PARG功能缺失會(huì)造成神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育終止，這些可能都與PAR過度積累有關(guān)[24].

我們研究了PARP基因家族成員PARP2的突變對(duì)parg1-4表型的影響，發(fā)現(xiàn)雙突變體p2g1部分恢復(fù)了parg1-4對(duì)雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑zeocin和單鏈斷裂誘導(dǎo)劑MMS敏感的表型.我們推測(cè)當(dāng)PARG1突變后，可能由于PARP1或者PARP2產(chǎn)生的PAR不能及時(shí)被降解，從而導(dǎo)致了parg1-4對(duì)基因毒劑敏感，但是這些PAR究竟是由其中一個(gè)PARP產(chǎn)生，還是由它們共同產(chǎn)生，目前尚不清楚.Western blot結(jié)果顯示：在zeocin和MMS處理下，parg1-4中PAR的信號(hào)很強(qiáng)，且鏈長(zhǎng)分布范圍廣，從低到高都有，而雙突變體p2g1中PAR的信號(hào)強(qiáng)度大大弱于parg1-4，一些分子量較大和較小的PAR信號(hào)消失了，這部分信號(hào)可能由PARP2貢獻(xiàn)；而剩余的信號(hào)主要在130kDa到250kDa區(qū)間，這一部分信號(hào)可能由PARP2之外的PARP成員比如PARP1產(chǎn)生.p2g1雙突變體表型的部分恢復(fù)，說明PARP1和PARP2都與parg1-4突變體中PAR的積累有關(guān)，被修飾蛋白質(zhì)總體減少或者修飾水平的降低，更有利于植物的生存.PARP2的突變導(dǎo)致了PAR大大減少，從而減輕了parg1-4的死亡相關(guān)癥狀.

在zeocin處理下，p2g1中130kDa到250kDa區(qū)間修飾條帶的信號(hào)強(qiáng)度略強(qiáng)于parp2-3，而弱于parg1-4，推測(cè)在p2g1和parp2-3體內(nèi)這些PAR信號(hào)主要由PARP1產(chǎn)生，修飾的蛋白可能主要參與了DNA的修復(fù).parg1-4中高強(qiáng)度的PAR信號(hào)則可能激發(fā)了細(xì)胞的死亡，因?yàn)閺膠eocin平板上的生長(zhǎng)情況看，除parg1-4外，其他材料未在很短的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)死亡表型.在MMS處理下，24h時(shí)p2g1中130kDa到250kDa區(qū)間修飾條帶的信號(hào)強(qiáng)度略強(qiáng)于parp2-3，48h時(shí)二者信號(hào)強(qiáng)度接近，結(jié)合根長(zhǎng)和鮮重的定量結(jié)果，p2g1并未完全恢復(fù)到與parp2-3一樣的表型，說明在面臨單鏈DNA斷裂修復(fù)時(shí)，還有其他PARP比如PARP1也起了作用.p2g1比parp2-3略敏感、PAR水平略高的原因可能是由于在PARG1基因突變的背景下，PARP1產(chǎn)生的PAR也不能被及時(shí)降解，從而這部分PAR也有所積累.總之，在zeocin和MMS處理下，p2g1雙突變體中的PAR信號(hào)強(qiáng)度都明顯弱于parg1-4，長(zhǎng)鏈PAR也減少，說明PAR的大量產(chǎn)生確實(shí)是parg1-4對(duì)基因毒劑異常敏感表型的原因，而雙突變體中PAR水平明顯降低使得其表型部分恢復(fù).

當(dāng)植物體內(nèi)出現(xiàn)DNA損傷時(shí)，會(huì)激活一系列的DNA損傷響應(yīng)基因的表達(dá).其中PARP1能迅速識(shí)別DNA損傷位點(diǎn)，激活自我修飾活性，同時(shí)募集其他蛋白結(jié)合到損傷位點(diǎn)[25]，BRCA1是參與DNA修復(fù)和染色質(zhì)重塑的一種抑癌因子，可被磷酸化的組蛋白變體γH2AX招募至損傷位點(diǎn)[26-27].PARP1和BRCA1都屬于識(shí)別DNA損傷的初始反應(yīng)因子；SOG1則是DNA損傷途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能啟動(dòng)細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)、DNA修復(fù)及細(xì)胞死亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[28].zeocin處理后，在所有基因型植物中，PARP1、BRCA1和SOG1在6h內(nèi)基因表達(dá)量都有一個(gè)明顯的上調(diào)，說明它們都迅速地響應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈損傷，但是，在雙突變體p2g1中，PARP1、BRCA1和SOG1的表達(dá)量都明顯低于parg1-4，說明在parg1-4背景下，PARP2再次突變可使得parg1-4中損傷響應(yīng)基因的表達(dá)量下降；在parp2-3單突變體中這些基因的表達(dá)水平也明顯低于雙突變體p2g1.這些結(jié)果表明：雙突變體中DNA損傷反應(yīng)可能不如單突變體parg1-4嚴(yán)重，而更接近于parp2-3單突變體和野生型.在MMS處理的情況下，這3個(gè)基因的表達(dá)峰值盡管比zeocin處理時(shí)滯后出現(xiàn)，但在p2g1雙突變體中，它們的表達(dá)水平也同樣更接近于parp2-3，而顯著區(qū)別于parg1-4.這些數(shù)據(jù)也與植物所呈現(xiàn)出來(lái)的表型相一致.

Metacaspases是一類存在于植物、真菌和原生生物中的蛋白酶[29]，擬南芥的基因組中編碼9個(gè)metacaspases[30]，其中MC1能正調(diào)控病原菌引起的細(xì)胞死亡[31]，MC8能被紫外線、H2O2和甲基紫精等氧化脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[32].在zeocin和MMS脅迫后期，MC1和MC8在parg1-4中的表達(dá)量明顯高于p2g1，它們?cè)趐arp2-3和p2g1的表達(dá)量也較為接近.p2g1體內(nèi)細(xì)胞死亡因子表達(dá)水平的降低，從分子水平上說明PARP2突變確實(shí)部分恢復(fù)了parg1-4對(duì)zeocin和MMS敏感的表型.

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了PARP2突變可部分恢復(fù)parg1-4對(duì)基因毒劑敏感的表型，其機(jī)理與PARP2突變降低了parg1-4體內(nèi)PAR的水平和DNA損傷及細(xì)胞死亡響應(yīng)基因的表達(dá)水平有關(guān)，這些結(jié)果為了解PARP家族成員PARP2的活性與parg1-4表型的關(guān)系提供了新的理論依據(jù).