七厘散治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎及其相關(guān)分子機(jī)制研究

宋寒冰,劉家興,王革強(qiáng),張大鵬,姜益常,任樹(shù)軍,王 飛

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種復(fù)雜和多因素的異質(zhì)性疾病征，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、周圍肌肉萎縮等[1]。流行病學(xué)顯示我國(guó)KOA發(fā)病率達(dá)到8.1 %，并且在60歲以上人群中更是高達(dá)30 %[2]。Wnt/β-catein信號(hào)通路是KOA的發(fā)生的重要代謝途徑，大量實(shí)驗(yàn)表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過(guò)影響骨骼，軟骨和滑膜組織而在骨骼和關(guān)節(jié)病理中起一定作用[3-4]。目前治療KOA常用藥物有關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物如透明質(zhì)酸[5]，改善病情類藥物如氨基葡萄糖[6]，而中藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為對(duì)KOA的治療較為突出的方法之一。

七厘散是由多味中藥組成的傳統(tǒng)的名方[7]。其藥材組成有秦皮113 g，川貝母、除蟲(chóng)菊酯各80 g和龍骨57 g[8]。臨床上七厘散既可口服，亦可外用，如七厘散藥膏對(duì)關(guān)節(jié)炎的療效較佳[9]，七厘散在軟組織挫傷恢復(fù)中療效也非常顯著[10]。關(guān)于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制目前發(fā)現(xiàn)較多的是Wnt/β-catenin信號(hào)通路，其與軟骨退化、軟骨下骨重塑等有密切關(guān)系[11]。但七厘散是否通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路治療膝骨關(guān)節(jié)炎尚不清楚。

因此本研究通過(guò)建立KOA兔模型，并制備七厘散含藥血清，進(jìn)一步研究七厘散促進(jìn)骨膜間質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的增殖和成骨分化發(fā)揮緩解膝骨關(guān)節(jié)炎的作用，以及對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑：七厘散由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)系提供。胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：11011-8611)，α-最低必需培養(yǎng)基(北京華新康信生物科技有限公司，批號(hào)：SH30024.01)；青霉素-鏈霉素(碧云天生物有限公司，批號(hào)：ST488)；ELISA檢測(cè)試劑盒(博士德，批號(hào)：ERC010)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(無(wú)錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：PH-B-002)。DKK-1(碧云天生物有限公司，批號(hào)：AF2056)，Wnt4a(Abcam，批號(hào)：ab219412)。

1.1.2 動(dòng)物：SPF級(jí)健康新西蘭大兔由哈爾濱市呼蘭區(qū)白奎鎮(zhèn)天興養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：23002000000209，體重(2.0±0.2) kg，雌雄各半，一兔一籠。幼齡SD大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為：No.1140070021239A。動(dòng)物飼養(yǎng)于普通動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室溫20～25 ℃，濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食飲水。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)：首先從5只SPF級(jí)SD幼齡大鼠中獲得骨髓，使用20 ml注射器沖洗所得骨髓，收集得到所有骨髓沖洗液，使用密度梯度離心獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)[12]，接種到10%FBS的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(OIM)中，并在37 ℃，5%CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)與傳代，將第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。另外取5只SPF劑SD幼齡大鼠進(jìn)行灌胃七厘散(0.40 g/kg)，6 h后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血得到含藥血清，用于給藥。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模及給藥：大兔通過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其分為對(duì)照組與七厘散組，每組各10只，雌雄各半。七厘散兔以2%戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉[13]，采用2%木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射構(gòu)建模型，分別于第1、3、5天多位點(diǎn)注射到大兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每次0.5 ml/膝，并將兔膝關(guān)節(jié)強(qiáng)迫屈曲位保持1周，1周后進(jìn)行X線片拍攝，曝光量為55 mA/s，觀察關(guān)節(jié)面形態(tài)變化，采用膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)估KOA模型，具體依據(jù)Kellgren-Lawrecne[14]。造模結(jié)束后灌胃七厘散組兔七厘散(0.25 g/kg)，持續(xù)14 d。

1.2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)：MTT法測(cè)定七厘散含藥血清對(duì)BMSCs的增殖的影響。在96孔板中接種BMSC，密度為1×104/孔，加入α-MEM后再孵育24 h，在加入七厘散含藥血清后培養(yǎng)1、2、3、7和14 d。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，棄去上清液后在每孔加入100 μl濃度為1 mg/ml的MTT溶液，并在37 ℃，5% CO2的條件下孵育4 h后，棄去上清，每孔加入150 μl的DMSO，在酶標(biāo)儀中震蕩1～2 min，560 nm下測(cè)定其吸光度。

1.2.3 ALP活性測(cè)定：當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(OIM)與七厘散含藥血清的OIM中培養(yǎng)第1、2、3、7、14天時(shí)，各組的ALP活性使用ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)：Trizol提取細(xì)胞總RNA，并用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。我們使用β-肌動(dòng)蛋白作為參考對(duì)照。Runx2、Osteocalcin、β-catenin、Wnt4a、Wnt7的相對(duì)mRNA水平表示為歸一化為β-肌動(dòng)蛋白mRNA的倍數(shù)變化，并根據(jù)2-ΔΔCt比較法。RT-PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃、2 min；53 ℃、20 s，60 ℃、40 s，共45個(gè)循環(huán)。GAPDH的cDNA經(jīng)倍比稀釋后進(jìn)行同期PCR，用于回歸分析。

1.2.5 免疫組化法：取七厘散組兔軟骨組織適量，關(guān)節(jié)軟骨解剖分離關(guān)節(jié)腔，攝像，肉眼觀察關(guān)節(jié)面軟骨的病理改變情況，并記錄觀察結(jié)果，以手術(shù)刀片取出負(fù)重面的全層關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，軟骨組織的一部分獲得固定在10 %中性多聚甲醛在4 ℃，用EDTA脫鈣、乙醇脫水、石蠟包埋、然后切片(厚度約4～5 μm)。以上切片經(jīng)鏈霉親和素過(guò)氧化物酶法處理，二甲苯脫蠟、乙醇脫水，滴加雙氧水進(jìn)行抗原修復(fù)，依次加入Wnt4a(1∶100)一抗、二抗。經(jīng)抗孵育和DAB顯色后，采用蘇木精復(fù)染。常規(guī)脫水、透明貼裝后置于顯微鏡下觀察、讀取陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。每組隨機(jī)選擇5個(gè)視野，重復(fù)6次，后取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。使用單向ANOVA評(píng)估結(jié)果,采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 X線片觀察治療前后兔膝關(guān)節(jié)炎病理情況 本研究中，首先于治療前對(duì)所有大兔進(jìn)行了右后肢X線拍攝，驗(yàn)證了大兔KOA模型的構(gòu)建，X線片顯示，正常組兔膝關(guān)節(jié)對(duì)稱、間隙正常，關(guān)節(jié)面光滑，邊緣規(guī)則整齊無(wú)骨贅，軟骨下骨密度均勻(圖1A)；成模后的兔膝關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)面粗糙，明顯退變，關(guān)節(jié)周圍骨贅形成，軟骨下骨出現(xiàn)明顯高密度影，關(guān)節(jié)間隙變窄，接近于人膝骨關(guān)節(jié)炎的影像學(xué)改變，模型構(gòu)建成功(圖1B)。治療后，X線片顯示，對(duì)照組(圖1C)兔膝關(guān)節(jié)較治療前無(wú)明顯變化；七厘散組(圖1D)兔膝關(guān)節(jié)表面較光滑，少數(shù)可見(jiàn)關(guān)節(jié)間隙狹窄及軟骨下骨高密度影。依據(jù)Kellgren-Lawrecne影像學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0-Ⅳ級(jí)分別記為0～4分，治療前后X線正位片評(píng)分顯示，七厘散組Kellgren-Lawrecne評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.001)；經(jīng)七厘散治療后，七厘散組的Kellgren-Lawrecne評(píng)分顯著低于治療前評(píng)分(P<0.01)。見(jiàn)表1。

A：造模前；B：造模后；C：治療后對(duì)照組；D：治療后七厘散組

2.2 七厘散含藥血清顯著促進(jìn)BMSCs增殖 MTT檢測(cè)結(jié)果表明(圖 2)，與對(duì)照組相比，七厘散血清組在第1、2、3、7、14天可促進(jìn)BMSCs增殖，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與七厘散血清組相比，DKK-1組(0.1 μg/kg，0.2 μg/kg)對(duì)BMSCs的增殖程度明顯降低，且高劑量DKK-1抑制作用更為明顯，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組治療前后Kellgren-Lawrecne評(píng)分比較(分)

2.3 七厘散含藥血清增加ALP活性 ALP結(jié)果表明(圖 3)所示：與對(duì)照組相比，七厘散血清組在第1、2、3、7、14天顯著增加ALP活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與七厘散血清組相比，加入抑制劑DKK-1后，ALP活性明顯被抑制，且高劑量DKK-1(0.2 μg/kg)比低劑量DKK-1(0.2 μg/kg)抑制作用明顯。

圖2 MTT測(cè)定BMSC增殖情況(n=6)

注：與對(duì)照組比較，###P<0.001；與QLS組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 七厘散含藥血清增加Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因表達(dá) PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，七厘散含藥血清組能夠顯著上調(diào)成骨基因Runx2、Osteocalcin、β-catenin、Wnt4a的表達(dá)以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)(圖 4)。當(dāng)加入抑制劑DKK-1(0.1 μg/kg，0.2 μg/kg)后，七厘散含藥血清的作用得到抑制。

注：與對(duì)照組比較，###P<0.001；與七厘散組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.5 七厘散對(duì)兔軟骨組織中Wnt4a陽(yáng)性表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示(圖 5)，對(duì)照組兔的軟骨組織中未見(jiàn)Wnt4a的表達(dá)。與對(duì)照組相比，七厘散組治療前可見(jiàn)少量的Wnt4a的表達(dá)，即分布的棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞(即圖中色深者)，七厘散組治療后，兔軟骨組織有大量多而密集的棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞，提示W(wǎng)nt4a在治療后的七厘散組中有大量的表達(dá)。

3 討 論

KOA是一種以軟骨退變、磨損為病理表現(xiàn)的疾病，軟骨細(xì)胞終末分化導(dǎo)致合成/分解代謝負(fù)平衡甚至凋亡是OA軟骨缺損修復(fù)困難和OA進(jìn)展的關(guān)鍵原因之一[15-16]。本實(shí)驗(yàn)采用2%木瓜蛋白酶溶液關(guān)節(jié)腔注射以及復(fù)合強(qiáng)迫屈曲位法構(gòu)建兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)模型，探討七厘散對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎的改善情況[17]。七厘散出自清代謝元慶所著的《良方集腋》，在臨床上廣泛用于治療各種跌打損傷、外傷瘀血等[18]。

圖5 兔軟骨組織中Wnt4a陽(yáng)性表達(dá)顯微圖 (免疫組化染色)

病理研究中彭細(xì)果等[19]研究表明七厘散治療軟組織損傷有顯著的療效，且能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。本研究中發(fā)現(xiàn)七厘散治療后的KOA兔的膝關(guān)節(jié)表面較光滑，只有少數(shù)可見(jiàn)關(guān)節(jié)間隙狹窄及軟骨下骨高密度影，可見(jiàn)七厘散能夠改善KOA兔模型的病理情況；其次七厘散含藥血清顯著促進(jìn)BMSC增殖，這與謝興文等[20]分析七厘散對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的結(jié)果一致。但目前對(duì)其分子機(jī)制尚未有明確的報(bào)道，為此，本文進(jìn)一步對(duì)其相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21-22]Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)節(jié)生物學(xué)及組織平衡中起關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路改變影響軟骨下骨生長(zhǎng)板破骨細(xì)胞活性，從而導(dǎo)致軟骨下骨硬化或關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成[23]。而Runx2作為Wnt蛋白的靶基因可顯著抑制骨膜成骨和骨內(nèi)成骨的發(fā)生[24]。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)骨祖細(xì)胞中Runx2的表達(dá)從而可進(jìn)一步使得Osteocalcin的沉積[25-26]。因此本實(shí)驗(yàn)探究七厘散是否能激活Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)骨細(xì)胞增殖，治療膝骨關(guān)節(jié)炎。本實(shí)驗(yàn)首先探究了七厘散對(duì)成骨基因和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相關(guān)基因表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)七厘散可以提高Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt4a的mRNA水平。加入DKK-1抑制劑后Runx2、Osteocalcin、β-catenin、Wnt4a的表達(dá)水平顯著降低，且較高的DKK-1劑量(0.2 μg/kg)比較低的DKK-1劑量(0.1 μg/kg)的抑制作用更明顯。同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示，七厘散治療后的兔軟骨組織中Wnt4a的陽(yáng)性細(xì)胞較治療前顯著增加，提示七厘散激活了Wnt4a的表達(dá)。

綜上所述，七厘散可減輕KOA模型兔軟骨的損傷程度，這種改善作用可能與增加Runx2，Osteocalcin基因的表達(dá)以及激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨分化有關(guān)。